特异性靶向类风湿关节炎炎性滑膜细胞的适配子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，提供了一种特异性靶向人类风湿关节炎炎性滑膜细胞的适配子，所述适配子具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列；本发明专利技术进一步提供了所述适配子在制备识别炎性滑膜细胞的生物探针的应用和在制备靶向性抗类风湿性关节炎药物或药物载体的应用。本发明专利技术所述适配子对炎性滑膜细胞的具有高选择性，且消除或弱化了与肝细胞结合；含有本发明专利技术适配子的生物探针可识别体外人炎性滑膜细胞，如RA病人滑膜组织切片中的炎性滑膜细胞，为临床RA诊断和靶向治疗提供了依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种特异性靶向人体类风湿关节炎炎性滑膜细胞的单链DNA适配子及其应用。
技术介绍
类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种以多关节滑膜炎症性病变为特征的慢性全身性自身免疫性疾病，号称″致残疾病之首″，被世界医学界称为不死的癌症，已成为21世纪威胁人类健康的四大顽疾之一。RA在成人中发病率较高，每10万成年人口中约有20-40％的发病率。研究显示，10％的RA患者在发病2年内即可出现严重的功能障碍，约50％的患者在患病10年后丧失劳动能力。目前，我国RA患者年人均疾病费用达13506元人民币，占当年人均国内生产总值(GDP)的51％，给患者和社会都造成严重的经济负担。RA至今尚无特效治疗方法。传统的抗风湿药物包括非甾体抗炎药、激素、抗风湿药等疗效不高，且存在毒副作用及耐药性。新型生物制剂可有效改善RA病情，成为近年来RA治疗的新里程碑。肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂已经成为针对RA的共识性生物治疗剂。然而，接受TNF抑制剂治疗的患者存在严重感染等并发症的风险，限制了临床应用。因此，开发具有高效、低毒的抗RA替代药物尤为必要。寡核苷酸适配子是通过SELEX过程筛选的与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA或RNA片段，其作为抗体分子的前景性替代分子，其研究较为引人注目。SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)技术是九十年代发展起来的一种新的体外筛选技术，它运用大容量的随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子 特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得高亲合力、特异性强的寡核苷酸适配子(aptamers)，已成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、蛋白质、药物、氨基酸以及各种细胞因子等，甚至可用于完整的细胞、病毒、孢子和朊病毒等。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具有更高的亲合性和特异性，近年来核酸适配子不断被应用于基础研究、药物开发、临床应用等方面，具有良好的应用前景。特异结合于病变细胞的核酸适配子有利于疾病的诊断和治疗。与抗体相比，适配子有如下优点：化学稳定性高，可以耐受80℃的高温，可在蛋白药物不能耐受的各种溶剂和恶劣条件下储存；无免疫原性，可反复给药，安全性优于单克隆抗体；批间差异小，质量稳定，有利于工业化生产；容易进行各种化学修饰，便于扩展其应用范围；相对分子质量小，容易渗透入组织内部。基于上述优势，适配子在很多生物应用方面可以替代抗体。适配子出现十多年来，已应用于酶联寡核苷酸实验、流式细胞仪、适配子芯片(aptamer chip)、蛋白定量及蛋白纯化等体外实验，同时具有可在体内抑制生长因子和受体的相互作用或抑制酶活性等功能，还可进行体内成像等。适配子可作为诊断和治疗试剂，用于诊断时可识别与结合特定靶分子，用于治疗时可作为靶向输送、功能阻断物质或者直接阻断疾病进程。CN 200610015738.0公开了一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子及其制备方法与应用；CN201210224174.7公开了一种用于血小板衍生生长因子检测的核酸适配子分子信标探针；CN201410468490.8公开了一种心肌肌钙蛋白I核酸适配子及其应用、试剂盒；CN 201010295767.3公开了一种特异识别志贺氏菌的核酸适配子及其筛选方法与应用；CN201210240284.2公开了一种能特异结合结核菌抗原的核酸适配子及其应用。然而到目前为止，尚未发现成功将SELEX筛选技术用于开发类风湿关节炎诊断试剂及治疗药物的报道。
技术实现思路
针对以上技术情况，本专利技术提供了一种特异性、高亲和力结合人类风湿关节炎炎性滑膜细胞膜表面的单链DNA适配子，所述适配子具有如下SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列：SEQ ID NO.1：5’-GCAAC CAGGG GAACC GGGGA ATTGGAACGC TTTCC TCCCG TTGGC-3’；所述适配子具有图4示二级结构。本专利技术还提供了一种特异性靶向炎性滑膜细的适配子的筛选方法，所述方法包括：(1)随机ssDNA文库的构建和引物的合成构建长度为81nt的随机文库，两端为固定序列，中间为45个核苷酸随机序列，库容量大约为IO15-IO16，根据随机ssDNA文库两端固定序列设计上下游引物。ssDNA文库的序列：5′-ATCCAGAGTGACGCAGCA-(45N)-TGGACA CGG TGG CTT AGT-3′，其中N代表A，T，C，G四个随机碱基；上游引物P1：5′FITC-ATC CAG AGT GAC GCA GCA-3′；下游引物P2：5′Biotin-ACTAAG CCA CCG TGT CCA-3′；(2)SELEX筛选靶细胞(人成纤维滑膜细胞)和负筛选细胞(肝细胞)的培养；靶细胞、负筛选细胞与ssDNA文库孵育； 与靶细胞结合ssDNA的扩增；链酶亲和素磁珠法制备ssDNA文库；重复上述过程，共进行8-12轮筛选；(3)流式细胞仪监测DNA适配子的各轮筛选富集情况制备FITC标记ssDNA；靶细胞的处理；靶细胞与FITC标记ssDNA孵育；流式细胞术检测，通过荧光强度值的大小比较富集的情况。(4)克隆与测序 经多轮筛选得到的ssDNA用PCR扩增dsDNA，回收纯化连接T载体，经蓝白斑筛选，随机挑选多个克隆进行序列测定。(5)DNA适配子一、二级结构分析和预测及同源序列分析。作为本专利技术实施方案之一，所述筛选方法进一步包括：(6)DNA适配子特异性的鉴定流式细胞术检测DNA适配子与靶细胞(人成纤维样滑膜细胞)结合的亲和力解离常数Kd；DNA适配子特异性的鉴定通过流式细胞术检测筛选得到的DNA适配子与人成纤维样滑膜细胞、肝细胞及人Kupffer细胞的亲合力以鉴定其特异性。DNA适配子体外选择性鉴定通过荧光显微镜成像和流式荧光强度变化，初步分析ssDNA适配子对靶细胞的选择性。作为本专利技术实施方式之一，所述筛选方法中的人成纤维样滑膜细胞包括但不限于MH7A细胞。作为本专利技术实施方式之一，所述筛选方法中的肝细胞包括但不限于L-02细胞。作为本专利技术实施方式之一，所述特异性靶向人类风湿关节炎炎性滑膜细胞的适配子的筛选方法包括：(1)合成随机单链DNA文库和引物 随机文库： 5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA-(45N)-TGGACACGGTGGCTTAGT-3’5’引物：5’-FITC-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3’3’引物：5’-biotin-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’(2)SELEX筛选人成纤维样滑膜细胞MH7A(靶细胞)和人肝细胞L-02(负筛选细胞)细胞培养及筛选前处理。采用无酶的细胞消化液处理生长状况良好的细胞，按2×105个细胞接种于P100培养皿中培养，当细胞的融合率达到95％即可用于文库的筛选。靶细胞、负筛选细胞与ssDNA文库孵育及筛选收集约1×106个MH7A细胞，用Washing Buffer(DPBS+CaCl2+MgCl2)洗涤细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性靶向人类风湿关节炎炎性滑膜细胞的适配子，其特征在于，所述适配子具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种特异性靶向人类风湿关节炎炎性滑膜细胞的适配子，其特征在于，所述适配子具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。2.一种特异性靶向人类风湿关节炎炎性滑膜细胞的适配子的筛选方法，其特征在于，所述方法包括：(1)随机ssDNA文库的构建和引物的合成构建长度为81nt的随机文库，两端为固定序列，中间为45个核苷酸随机序列，库容量大约为IO15-IO16，根据随机ssDNA文库两端固定序列设计上下游引物；ssDNA文库的序列：5′-ATCCAGAGTGACGCAGCA-(45N)-TGG ACA CGGTGGCTTAGT-3′，其中N代表A，T，C，G四个随机碱基；上游引物P1：5′FITC-ATC CAG AGT GAC GCA GCA-3′；下游引物P2：5′Biotin-ACTAAG CCA CCG TGT CCA-3′；(2)SELEX筛选靶细胞-人成纤维滑膜细胞和负筛选细胞-肝细胞的培养；靶细胞、负筛选细胞与ssDNA文库孵育；与靶细胞结合ssDNA的扩增；链酶亲和素磁珠法制备ssDNA文库；重复上述过程，共进行8-12轮筛选；(3)流式细胞仪监测DNA适配子的各轮筛选富集制备FITC标记ssDNA；靶细胞的处理；靶细胞与FITC标记ssDNA孵育；流式细胞术检测，通过荧光强度值的大小比较富集的情况；(4)克隆与测序经多轮筛选得到的ssDNA用PCR扩增dsDNA，回收纯化连接T载体，经蓝白斑筛选，随机挑选多个克隆进行序列测定；(5)DNA适配子一、二级结构分析和预测及同源序列分析，即得。3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于所述方法，进一步包括：(6)DNA适配子特异性的鉴定流式细胞术检测DNA适配子与滑膜细胞结合的亲和力解离常数Kd；DNA适配子特异性的鉴定通过流式细胞术检测筛选得到的DNA适配子与成纤维样滑膜细胞、肝细胞及人Kupffer细胞的亲合力以鉴定其特异性；DNA适配子体外选择性鉴定：通过荧光显微镜成像和流式荧光强度变化，初步分析ssDNA适配子对靶细胞的选择性。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述人成纤维滑膜细胞为MH7A滑膜细胞。5.根据根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述肝细胞为L-02肝细胞。6.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述方法包括：(1)合成随机单链DNA文库和引物随机文库：5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA-45N-TGGACACGGTGGCTTAGT-3’5’引物：5’-FITC-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3’3’引物：5’-biotin-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’(2)SELEX筛选靶细胞人成纤维样滑膜细胞MH7A和负筛选细胞人肝细胞L-02细胞培养及筛选前处理：采用无酶的细胞消化液处理生长状况良好的细胞，按2×105个细胞接种于P100培养皿中培养，当细胞的融合率达到95％即可用于文库的筛选；靶细胞、负筛选细胞与ssDNA文库孵育及筛选：收集约1×106个MH7A细胞，用Washing Buffer(DPBS+CaCl2+MgCl2)洗涤细胞2次，Binding Buffer(DPBS+CaCl2+MgCl2+tRNA)洗涤细胞一次；将上述文库8nmol与洗涤后的靶细胞在37℃孵育1h，用Washing Buffer洗涤细胞2次，向细胞沉淀中加入超纯水500ul，95℃水浴10min，于4℃，13600g离心10min，收集上清，上清中含有第一轮筛选特异结合的ssDNA，上清液作为模板可用于PCR扩增，制备下一轮筛选的亚文库。-80℃冻存备用；第一轮筛选后的单链DNA文库PCR扩增通过上、下游引物将单链DNA文库扩增为双链DNA文库，扩增条件为：于95℃预变性3min，再进行94℃，30s，56℃，30s，72℃，30s，共12个循环，72℃延伸3min；将双链DNA PCR产物作为模板，进行第二次扩增循环数摸索，扩增条件为：95℃预变性3min，再进行94℃，30s，56℃，30s，72℃，30s，分别扩增6、10、14、18、22、26、30个循环，72℃延伸3min；将PCR扩增产物行3％凝胶电泳鉴定，选择最佳扩增循环数5；按照上述PCR条件把剩余的第一次PCR产物继续扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕爱平，张戈，吕诚，何小鹃，刘彪，张广献，何冰，梁超，刘进，
申请(专利权)人：中国中医科学院中医临床基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11