一种用于抑制靶基因mRNA表达的寡核酸分子及其成套组合物制造技术

本发明专利技术公开了一种用于抑制靶基因mRNA表达的寡核酸分子及其成套组合物。本发明专利技术提供了siRNA，由19‑27个核苷酸组成的正义链和与其反向互补的反义链组成；所述正义链中从5’末端起5‑9个连续核苷酸和从3’末端起5‑9个连续核苷酸均为2＇－核糖修饰核苷酸。本发明专利技术中siRNA分子混合物可以影响至少50％、55％、60％、65％、70％,75％、80％、85％、90％的细胞中靶基因的表达，抑制率至少为45％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种用于抑制靶基因mRNA表达的寡核酸分子及其成套组合物。
技术介绍
自Andrew Fire和Craig Mello等人1998年在线虫(Caenorhabditis elegans)中首次发现RNAi现象，Tuschl和Phil Sharp等人2001年证实在哺乳动物中也存在RNAi之后，关于RNAi的机制原理、基因功能和临床应用等研究取得了一系列的进展。RNAi不仅在防御病毒感染，防转座子跳跃等多种机体保护机制中发挥关键作用(Huntvagner et al,2001；Tuschl,2001；Waterhouse et al,2001；Zamore 2001)，其相关产品也是十分有前景的候选药物。Elbashir等人在2001年发现siRNA抑制哺乳动物细胞中特异基因的沉默，研究表明siRNA可特异的同序列互补的靶mRNA结合，并使其降解。长片段的双链RNA被Dicer酶切割成21-23个碱基长度短片段RNA，其中两条链中同靶mRNA结合的链称为反义链或引导链，另一条链称为正义链或过客链。研究发现体外化学合成的siRNA进入细胞后也同样发挥RNAi作用，而且有效降低了长链RNA引起的免疫反应。但由于siRNA的有效性受序列特异性，靶细胞特异性、靶点等多种因素影响，基于现有设计原则获得的siRNA并不是每个都能达到有效的沉默效果；一般设计的siRNA约有50％以上具有沉默靶mRNA的效果，仅25％的siRNA具有75％以上的沉默效果，因此后续对设计合成的siRNA还需要实验验证、筛选或优化，费时耗力；基于此，一种通用、高效、快速的RNAi技术与产品亟待开发。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种抑制或降低靶基因表达的siRNA。本专利技术提供的siRNA，由正义链和与其反向互补(完全反向互补)的反义链组成；所述正义链由19-27个核苷酸组成，且所述正义链从5’末端起5-9个连续核苷酸和从3’末端起5-9个连续核苷酸均进行2＇-O-核糖修饰。所述反义链与所述靶基因上的区段反向互补。siRNA通过其反义链与靶基因上的靶序列反向互补结合；在专利技术的一些实施例中,siRNA分子中至少包括一个非天然的核苷酸，如经化学修饰的核苷酸，优选在正义链或正义区的化学修饰。在一些实施例中，核糖的2＇-O-核糖修饰具体为2＇-O-甲基修饰，2＇-O-氟代修饰，2＇-MOE修饰。本专利技术的正义链修饰可起到：(1)增强siRNA分子稳定性；(2)减少siRNA分子脱靶性；(3)提高siRNA分子特异性；(4)减少免疫激活反应等作用。上述siRNA中，所述正义链由24、25或26个核苷酸组成；或，所述正义链从5’末端起6或7或8个连续核苷酸和从3’末端起6或7或8个连续核苷酸均进行2＇-O-核糖修饰。上述siRNA中，所述2＇-O-核糖修饰为2＇-O-甲基(2＇-O-Me)修饰、2＇-O-氟代修饰、或2＇-MOE修饰。本专利技术另一个目的是提供一种抑制或降低靶基因表达的成套siRNA。本专利技术提供的成套siRNA，包括至少5个上述的siRNA。每个siRNA对应同一靶基因的不同靶序列。上述成套siRNA中，所述成套siRNA由5、6、7、8、9或10个siRNA组成。上述成套siRNA中，所述成套siRNA中单个siRNA分子的的物质的量可以是随机的，任2个siRNA的物质的量比为1:1-1:5；优选单个siRNA分子的的物质的量相等1:1。本专利技术另一个目的是提供另一种如下1)或2)物质。本专利技术提供的1)或2)物质：1)抑制或降低靶基因表达的试剂，其为如下A或B：A包括权利要求1-3任一所述的siRNA和转染试剂；B包括权利要求4或5所述的成套siRNA和转染试剂；2)抑制或降低靶基因表达的试剂盒，其包括上述siRNA或上述的成套siRNA或所述试剂。上述物质中，所述成套siRNA中所有siRNA分子在所述试剂中的总浓度为2-100nM；每个siRNA分子在所述试剂中的浓度均为10-20nM；上述siRNA或上述的成套siRNA或上述的物质在抑制或降低靶基因表达中的应用也是本专利技术保护的范围；或上述siRNA或上述的成套siRNA或上述的物质在抑制或降低细胞中靶基因表达中的应用也是本专利技术保护的范围；或上述siRNA或上述的成套siRNA或上述的物质在制备抑制或降低靶基因表达产品中的应用也是本专利技术保护的范围；或上述siRNA或上述的成套siRNA或上述的物质在制备抑制或降低细胞中靶基因表达中产品的应用也是本专利技术保护的范围；或上述siRNA或上述的成套siRNA或上述的物质在制备预防或缓解或治疗由靶基因表达引起的疾病中的产品中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：将抑制或降低靶基因表达的siRNA的正义链从5’末端起5-9个连续核苷酸和从3’末端起5-9个连续核苷酸均进行2＇-O-核糖修饰；所述siRNA由正义链和与其反向互补的反义链组成；所述正义链由19-27个核苷酸组成；所述反义链与所述靶基因上的区段反向互补。或所述2＇-O-核糖修饰具体为2＇-O-甲基修饰、2＇-O-氟代修饰、或2＇-MOE修饰。本专利技术第四个目的是提供一种产品。本专利技术提供的产品，包括上述siRNA或上述的成套siRNA或上述的物质；和/或，所述产品具有如下1)-3)中至少一种功能：1)抑制或降低靶基因表达；2)抑制或降低细胞中靶基因表达；3)预防或缓解或治疗由靶基因表达引起的疾病。上述中，所述靶基因为肿瘤、癌症、心血管疾病、炎症、传染病或罕见病相关基因；或，所述肿瘤、癌症、心血管疾病、炎症、传染病或罕见病相关基因具体为P65、SOD1、TP53、HIF1A、BIRC5、CTNNB1、PLK1、ERBB3、COPS5、WEE1、EIF4E、STAT3、CDH16、VEGFA、KRAS、MYC和/或CTGF；所述细胞具体为脊椎动物细胞、哺乳类动物细胞、灵长类动物细胞、人类细胞；或，靶基因异常表达的(表达水平高于正常受试者)或有基因缺陷的(如染色体异常或基因突变)的癌细胞、肿瘤细胞、炎性细胞、血液细胞、白细胞、脑细胞、肝细胞、肺细胞、肾细胞、乳腺细胞、宫颈细胞、内皮细胞、神经细胞、神经胶质细胞；或，所述细胞具体为HeLa、293T、A549或HUVEC细胞；或，所述产品具体为药物。上述靶基因可以是肿瘤或癌症相关基因，优选RELA、SOD1、TP53、HIF1A、BIRC5、CTNNB1、PLK1、ERBB3、COPS5、WEE1、EIF4E、STAT3、CDH16、KRAS、MYC、CTGF等基因。上述靶基因对应的siRNA如下：靶基因为P65，其对应的成套siRNA为RB-P65-D1、RB-P65-D2、RB-P65-D3、RB-P65-D4、RB-P65-D5、RB-P65-D6、RB-P65-D7中至少6个；靶基因为SOD1，其对应的成套siRNA为RB-SOD-D1、RB-SOD-D2、RB-SOD-D13、RB-SOD-D4、RB-SOD-D5、RB-SOD-D6、RB-SOD-D7、RB-SOD-D8、RB-SOD-D9、RB-SOD-D10中至少5个；靶基因为TP53，其对应的成套siRN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制或降低靶基因表达的siRNA，由正义链和与其反向互补的反义链组成；所述正义链由19‑27个核苷酸组成，且所述正义链从5’末端起5‑9个连续核苷酸和从3’末端起5‑9个连续核苷酸均进行2＇‑O‑核糖修饰；所述反义链与所述靶基因上的区段反向互补。

【技术特征摘要】
1.一种抑制或降低靶基因表达的siRNA，由正义链和与其反向互补的反义链组成；所述正义链由19-27个核苷酸组成，且所述正义链从5’末端起5-9个连续核苷酸和从3’末端起5-9个连续核苷酸均进行2＇-O-核糖修饰；所述反义链与所述靶基因上的区段反向互补。2.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于：所述正义链由24、25或26个核苷酸组成；或，所述正义链从5’末端起6或7或8个连续核苷酸和从3’末端起6或7或8个连续核苷酸均进行2＇-O-核糖修饰。3.根据权利要求2所述的siRNA，其特征在于：所述2＇-O-核糖修饰为2＇-O-甲基修饰、2＇-O-氟代修饰、或2＇-MOE修饰。4.一种抑制或降低靶基因表达的成套siRNA，包括至少5个权利要求1-3中任一所述的siRNA。5.根据权利要求4所述的成套siRNA，其特征在于：所述成套siRNA由5、6、7、8、9或10个siRNA组成；或，所述成套siRNA中任2个siRNA物质的量比为1:1-1:5；或，所述成套siRNA中各siRNA为等物质的量混合。6.如下1)或2)物质：1)抑制或降低靶基因表达的试剂，其为如下A或B：A包括权利要求1-3任一所述的siRNA和转染试剂；B包括权利要求4或5所述的成套siRNA和转染试剂；2)抑制或降低靶基因表达的试剂盒，其包括权利要求1-3任一所述的siRNA或权利要求4或5所述的成套siRNA或所述试剂。7.根据权利要求6所述的物质，其特征在于：所述成套siRNA中所有siRNA分子在所述试剂中的总浓度为2-100nM。8.权利要求1-3任一所述的siRNA或权利要求4或5所述的成套siRNA或权利要求6或7所述的物质在抑制或降低靶基因表达中的应用；或权利要求1-3任一所述的siRNA或权利要求4或5所述的成套siRNA或权利要求6或7所述的物质在抑制或降低细胞中靶基因表达中的应用；或权利要求1-3任一所述的siRNA或权利要求4或5所述的成套siRNA或权利要求6或7所述的物质在制备抑制或降低靶基因表达产品中的应用；或权利要求1-3任一所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张必良，杨秀群，丹米其·萨玛斯基，克雷格·梅洛，
申请(专利权)人：广州市锐博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44