本发明专利技术提供了一种寡核苷酸接头，具体地涉及用于用该接头构建核酸测序中单链环状文库，还可用于需要单链环状文库的测序平台。本发明专利技术具有测序通量高，准确度高和操作简便的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种寡核苷酸接头和利用该接 头构建核酸测序单链环状文库的方法及其应用。
技术介绍
第二代测序技术，又称新一代测序技术，是相应于以Sanger测序法为代表的第 一代测序技术而得名。第二代测序中3种主流测序技术分别为依次出现的Roche/454焦磷 酸测序、Illumina/Solexa聚合酶合成测序和ABI/SOLiD连接酶测序技术。与这些主流测序 平台相比较，Complete Genomics (简称CG)测序平台通量最高，每次运行可产生9. 9TB的 数据量，且每小时的产量可以达到50Gb，是目前主流测序平台的10-25倍。CG测序技术可 以实现单倍体读长大于99kb，而目前只有Illumina公司可以实现S-IOkb的单倍体读长，其 他主流的测序公司还不能实现该技术。此外CG测序仪的准确度可达到99. 999 %，优于目前 其他商业化的测序仪。 随着第二代高通量测序技术的应用和发展，RNA测序技术也日趋成熟。以Solexa 测序平台为代表的Illumina公司提供的RNA-seq测序技术效果不错，但是由于其构建的是 双链线性测序文库，此类文库并不适合于CG测序平台，同时也存在一些影响实验效率的繁 琐之处，比如在打断后需要用乙醇沉淀回收样品，才能进行后续的逆转录反应，该步骤不仅 影响实验速度，而且增加了操作的复杂度。 目前，本领域中尚没有令人满意的用于RNA测序的单链环状文库的构建方法，因 此，本领域迫切需要开发可高效地制备高质量的、可适用于CG测序平台的RNA测序的单链 环状文库的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效地制备高质量的、单链环状文库的方法以及用该方 法制备的高质量的单链环状文库。 在本专利技术的第一方面，提供了一种用于构建文库的寡核苷酸接头，该接头包括：第 一接头和弟一接头， 其中，第一接头具有式I所示的从5'至3'的结构： Z0-Z1-Z2-Z3 (I)式中， ZO为位于正义链的单链形式的AGACAAGCTC (SEQ. ID. NO. : 1)，并且所述ZO的5'端 是经硫代修饰的； Zl为位于正义链的单链形式的标签序列； Z2 为双链形式的 GATCGGGCTTCGACTGGAGAC(SEQ. ID. NO. :2); Z3为位于正义链的单链形式的核苷酸T。 在另一优选例中，所述的标签序列是长度为6-12个碱基的核苷酸序列。 在另一优选例中，所述的标签序列是长度为6-10个碱基的核苷酸序列。 在另一优选例中，所述的标签序列的核苷酸序列与ZO的序列不同。 在另一优选例中，所述的寡核苷酸接头的所述的第二接头具有式II所示的从5' 至3'的结构： Z4-Z5 (II) 式中， Z4为位于反义链（即互补链）的单链形式的核苷酸T ; Z5 为双链形式的 AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGA (SEQ. ID. NO. : 3)。 在本专利技术的第二方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有容器以及位于所述 容器中的本专利技术的第一方面中所述的用于构建文库的寡核苷酸接头。 在另一优选例中，所述的第一接头和第二接头位于相同或不同的容器中。 在本专利技术的第三方面，提供了一种构建测序文库的方法，所述的方法包括步骤： (a)对双链DNA片段进行末端修复，从而获得平末端的DNA片段； (b)对所述平末端的DNA片段的3'端添加碱基A，从而获得3'端加 A的DNA片 段； (c)对所述3'端加A的DNA片段，用本专利技术第一方面所述的接头进行连接反应，从 而获得两端加接头的DNA片段； ⑷将所述两端加接头的DNA片段作为模板，用特异性引物对进行PCR扩增，从而 获得DNA扩增产物，其中所述引物对中的一条引物标记有生物素； (e)对上一步骤中得到的所述DNA扩增产物，用包被有亲和素的珠子通过"亲和 素-生物素"的结合进行分离，从而捕获有生物素标记的PCR扩增产物； (f)对上一步骤中被捕获的带有生物素标记的PCR扩增产物，进行单链化处理，从 而获得单链DNA ; (g)对上一步骤中得到的所述单链DNA，在单链环化分子的存在下，进行单链环化 反应，从而获得含环化产物的混合物，即为测序文库。 在另一优选例中，步骤（c)中，所述的两端加接头的DNA片段具有式III所示的结 构： K1-K2-K3 (III) 式中 Kl为具有式I所示的从5'至3'的结构的第一接头： Z0-Z1-Z2-Z3 (I) K3为具有式II所示的从5'至3'的结构的第二接头： Z4-Z5 (II) K2具有式IV所示的从5'至3'的结构； Z3a-Z6-Z4a (IV) 上述各式中， Z3a为位于反义链的单链形式的核苷酸A ; Z4a为位于正义链的单链形式的核苷酸A ; Z6为待测序片段的序列； Z0、Zl、Z2、Z3、Z4、Z5具有如上所述的定义。 在另一优选列中，所述方法具有选自下组的一个或多个特征： (i)所述亲和素为链霉亲和素； (ii)步骤（d)中，所述的引物对包括： 正向引物：5-/phos/AGACAAGCTCNNNNNNNNNNGATCGGGCTTCGACTGGAGAC(SEQ ID NO. :4)和 反向引物：5-/bio/TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACT(SEQ ID NO. :5); 其中，5_/phos/表TK 5'末端核苷酸经过磷酸化修饰，5_/bio/表TK 5'末端核苷酸 经过生物素标记； (iii)步骤（g)中，所述的单链环化分子的序列为 TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC(SEQ ID NO. :6)； (iv)步骤（h)中，所述的核酸酶为外切酶； (V)步骤（h)中，所述的核酸酶为特异性切割单链和双链线性DNA的外切酶； (vi)所述的外切酶包括Exo I和Exo III的混合酶。 在另一优选例中，步骤（a)中的所述的双链DNA片段是通过如下步骤制备的： (a0)对mRNA样本进行片段化处理，从而获得片段化的mRNA ; (al)对所述片段化的mRNA进行反转录，从而获得cDNA扩增产物，作为双链DNA片 段。 在另一优选例中，所述双链DNA片段直接由DNA样本进行片段化处理后而获得。 在另一优选例中，所述方法还包括步骤： (h)对上一步骤中所述的混合物，用特异性切割线性DNA的核酸酶进行消化处理， 从而获得未环化的DNA片段被消化的混合物，其中上一步骤所述混合物中含有未消化的环 化产物；和 (i)任选地将上一步骤中所述未环化的DNA片段被消化的混合物进行纯化，从而 获得纯化的RNA测序单链环状文库。 在另一优选例中，步骤（e)中，所述亲和素为链霉亲和素。 在另一优选例中，步骤（d)中，所述的引物对包括： 正向引物：5-/phos/AGACAAGCTCNNNNNNNNNNGATCGGGCTTCGACTGGAGAC(SEQ ID NO. :4)和 反向引物：5-/bio/TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACT(SEQ ID NO. :5)， 其中，5_/phos/表TK 5'末端核苷酸经过磷酸化修饰，5_/bio/表TK 5'末端核苷酸 经过生物素标记。 在另一优选例中，步骤（g)中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于构建文库的寡核苷酸接头，其特征在于，所述的接头包括：第一接头和第二接头，其中，第一接头具有式I所示的从5'至3'的结构：Z0‑Z1‑Z2‑Z3 (I)式中，Z0为位于正义链的单链形式的AGACAAGCTC(SEQ.ID.NO.:1)，并且所述Z0的5'端是经硫代修饰的；Z1为位于正义链的单链形式的标签序列；Z2为双链形式的GATCGGGCTTCGACTGGAGAC(SEQ.ID.NO.:2)；Z3为位于正义链的单链形式的核苷酸T。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭晶，纪晓钧，祝珍珍，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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