一种寡核苷酸探针制造技术

本发明专利技术属于核酸探针技术领域，提供了一种寡核苷酸探针。该探针从5’‑3’端依次由与靶序列互补的序列、G‑四链体封闭序列和G‑四链体序列组成。G‑四链体封闭序列与部分G‑四链体序列互补，形成稳定的发夹结构，将G‑四链体序列封闭在探针内部。进行靶分子检测时，探针首先识别靶序列并形成双链结构，随后在Lambda核酸外切酶的消化作用下，打开发夹结构、释放G‑四链体序列，循环往复，最终将微量靶分子信息转换为大量G‑四链体序列，再通过G‑四链体序列转换为可读的光、电等信号。该探针具有稳定性好、成本低廉、易制备、高通量、灵敏度和特异性高的优势，可实现单链核酸的直接检测，也能对可诱导产生单链核酸的双链核酸及其它分子进行间接检测。

【技术实现步骤摘要】
一种寡核苷酸探针
本专利技术涉及核酸探针技术，具体涉及一种可以实现靶分子检测的寡核苷酸探针。
技术介绍
寡核苷酸是一类仅有几十个碱基的短链核酸，因其固有的核酸互补杂交特性及简单、可操作性强的结构特点，常被标记一定的化学基团后用作核酸探针，将核酸信号转化为光学或电学等可读信号，是核酸检测和分析的有力工具，这类探针即为寡核苷酸探针。较早应用的探针标记方式主要为放射性同位素标记，但易造成放射性污染，且存在同位素半衰期短、不稳定、成本高、操作不便、难以实现商品化等问题。因此，近年来许多实验室都致力于非放射性标记探针的发展，包括各种荧光小分子、金属(如汞)、半抗原(如地高辛)、生物素和酶等，其中应用最为广泛的是荧光标记。尽管这些技术具有更高的安全性和稳定性，但依然需要通过化学手段进行标记，成本高昂、应用门槛高、难以大范围推广。G-四链体是富含鸟嘌呤的核酸序列，四个鸟嘌呤碱基通过Hoogsteen氢键的作用形成一个平面正方形结构称为平面G-四分体，两个及更多的G-平面四分体结构堆积便可形成稳定的G-四链体空间结构。1996年，DipankarSen课题组通过体外筛选(SELEX)技术得到能与卟啉化合物特异识别的单链G-四链体序列，这类序列在一定溶液环境中可形成G-四链体空间结构与氯化血红素(Hemin)特异结合后，发挥较强的过氧化物酶活性，催化H2O2参与的氧化还原反应，可催化显色底物ABTS产生肉眼可识别的绿色颜色信号，催化化学发光底物鲁米诺分子产生化学发光信号，也可催化荧光前体分子如盐酸酪胺生成荧光底物后被激发产生荧光信号。此外，G-四链体还具有核酸适体的特性，可与荧光底物分子(如孔雀石绿、结晶紫等)作用后在特定波长的光激发下产生可检测的荧光信号。因此，这类G-四链体是一类典型的功能性核酸分子，可用于基因、小分子化合物、金属离子等的检测。Lambda核酸外切酶是从感染了λ噬菌体的大肠杆菌细胞中纯化出来的，它具有5’-3’端外切酶活性，能降解双链核酸中5’-磷酸化的单链，从而释放另一条普通单链。核酸探针分析技术正朝着灵敏快速、简便实用、经济有效的方向发展。在保证结果准确性的前提下，本专利技术结合G-四链体报告体系和Lambda核酸外切酶的作用，提供一种易制备、高稳定、高特异、低成本的寡核苷酸探针，能够与靶序列直接杂交并在室温条件下进行循环扩增，从而产生肉眼可视的颜色变化以及仪器可读的精确的光、电等信号，最终实现靶核酸的检测。
技术实现思路
本专利技术结合G-四链体报告体系和Lambda核酸外切酶的作用，提供一种易制备、高稳定、高特异、低成本的寡核苷酸探针，能够与靶序列直接杂交并进行等温循环扩增，从而产生肉眼可视的颜色变化以及仪器可读的精确的光、电等信号，最终实现靶核酸的检测。本专利技术的技术方案如下：探针的基本骨架是一段具有5’-粘性末端的DNA发夹序列，由5’-粘性末端、茎部和环部构成：5’-粘性末端为磷酸化标记序列，且能特异识别靶序列并通过碱基互补配对原则与之完全互补；茎部是由一段紧邻5’-粘性末端的G-四链体封闭序列和与之对应的位于探针3’-末端的G-四链体3’-端序列通过氢键形成的DNA双链区域；环部则为组成茎部的两段互补序列之间的一段DNA单链区域，也即G-四链体序列5’-端部分的序列。本专利技术所涉及的引入到探针中的G-四链体序列是一种能与卟啉铁等结合并具有过氧化物酶活性的脱氧核酶分子，该序列在反应中释放后，在一定溶液环境中能形成稳定的活性空间结构，通过加入Hemin、显色底物(ABTS、DAB等)或者荧光前体物质盐酸酪胺、H2O2，即可产生光、电等可读信号。当显色底物为ABTS时，可在室温下得到直接用肉眼便可观察和区分的颜色变化或用分光光度计测量反应液在414nm波长下的吸光值来反映信号强度，不存在靶分子的样品表现为无色，存在靶分子的样品呈绿色并随靶分子浓度由低到高显示由浅到深的绿色；当产生信号的物质为盐酸酪胺时，激发后可产生荧光信号(λex＝320nm，λem＝410nm)：存在靶分子的样品有荧光信号，而不存在靶分子的样品则不产生荧光信号。G-四链体还可直接与锌原卟啉结合，激发后产生荧光信号(λex＝420nm，λem＝590nm)，同样可以作为靶分子检测的信号报告方式。此外，G-四链体还可与DAB、鲁米诺、孔雀石绿、结晶紫等众多化合物发生类似的信号转换反应，最终将放大的靶分子信号转换为肉眼或仪器可读的光、电、压力等信号，从而实现靶分子的检测。本专利技术所述探针既可进行单链核酸的直接检测，也能对可诱导产生单链核酸的双链核酸及其它分子进行间接检测。本专利技术所述探针进行单链核酸检测的原理：当样本中不含靶核酸时，探针将保持稳定的发夹结构，无检测信号产生；当样本中含靶核酸时，探针的5’-粘性末端可对靶核酸序列进行特异性识别并与之互补形成双链，双链结构中的探针序列在Lambda核酸外切酶作用下发生5’-3’方向的消化反应，直至发夹被打开并释放出G-四链体，随后，新的探针可再与靶核酸互补并发生相同的反应，如此循环往复，释放大量G-四链体序列，从而达到将微量靶核酸转换为放大的G-四链体信号的目的，实现靶核酸的等温扩增和信号转换。本专利技术所述探针进行双链核酸检测的原理：检测双链核酸时，先通过一段普通引物、一段5’-磷酸化标记的引物及聚合酶链式反应(PCR)获得大量含5’-磷酸化单链的双链扩增产物；再在PCR扩增产物中加入根据5’-磷酸化单链的互补链设计的探针和Lambda核酸外切酶；Lambda核酸外切酶首先消化PCR双链产物中5’-磷酸化标记的单链，释放出可与探针5’-端粘性末端互补的单链DNA，随后探针识别释放出的单链DNA并互补形成双链区域，从而发生同单链检测体系相同的反应，将微量靶核酸转换为放大的G-四链体信号，最终实现双链核酸的等温扩增和信号转化。本专利技术所述探针的茎部起到了牢牢封闭G-四链体序列并稳定发夹结构的重要作用，使G-四链体在无靶分子存在时不能在溶液中形成空间二级结构，从而避免背景信号的产生。本专利技术所述探针的茎部互补序列需大于10个碱基对；探针与靶核酸互补序列也需大于10个碱基对。本专利技术所述探针对靶分子进行检测时，在检测体系中加入一定浓度的钠离子(50-200mM)，有利于发夹封闭序列更好的封闭G-四链体，形成稳定的双链结构，避免背景信号对检测结果判断造成干扰。本专利技术所述探针在室温条件下即可完成对靶分子的扩增和信号报告。表1.与卟啉铁等结合具有过氧化物酶活性的几个代表性G-四链体序列的名称及序列名称DNA序列T30695GGGTGGGTGGGTGGGTPW17GGGTAGGGCGGGTTGGGPS2.MGTGGGTAGGGCGGGTTGGCatG4TGGGTAGGGCGGGTTGGGAAAPS5.MGTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG表2.部分显色底物中英文全称如本文所用，除另外特殊说明，下列词语/术语具有下列含义。“DNA”：脱氧核糖核酸，是一类带有遗传信息的生物大分子，由4种主要的脱氧核糖核苷酸通过3′,5′-磷酸二酯键连接而成，是遗传信息的载体。“寡核苷酸”：小分子核酸，由核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成。“SELEX”：systematicevolutionofligandsbyex本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种寡核苷酸探针，其特征是：所述探针的基本骨架是一段具有5’‑粘性末端的DNA发夹序列，由5’‑端粘性末端、茎部和环部构成；5’‑粘性末端为磷酸化标记序列，且能特异识别靶核酸序列并与之互补；茎部是由一段紧邻5’‑粘性末端的G‑四链体封闭序列和与之对应的位于探针3’‑末端的G‑四链体3’‑端序列通过氢键形成的DNA双链区域；环部则为组成茎部的两段互补序列之间的一段DNA单链区域，也即G‑四链体序列5’‑端部分的序列；既可进行单链核酸的直接检测，也能对可诱导产生单链核酸的双链核酸及其它分子进行间接检测。

【技术特征摘要】
1.一种寡核苷酸探针，其特征是：所述探针的基本骨架是一段具有5’-粘性末端的DNA发夹序列，由5’-端粘性末端、茎部和环部构成；5’-粘性末端为磷酸化标记序列，且能特异识别靶核酸序列并与之互补；茎部是由一段紧邻5’-粘性末端的G-四链体封闭序列和与之对应的位于探针3’-末端的G-四链体3’-端序列通过氢键形成的DNA双链区域；环部则为组成茎部的两段互补序列之间的一段DNA单链区域，也即G-四链体序列5’-端部分的序列；既可进行单链核酸的直接检测，也能对可诱导产生单链核酸的双链核酸及其它分子进行间接检测。2.根据权利要求1所述的寡核苷酸探针，其特征是：探针中封闭的G-四链体序列是一...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐卓，李美，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川;51