一种基于核酸适配体检测四环素的生物传感器，包括：位于电解液内的三电极体系的丝网印刷电极，该丝网印刷电极具体包括：表面具有修饰四氧化三铁/还原氧化石墨烯‐海藻酸钠复合物层和四环素核酸适配体层的工作电极、作为对电极的碳电极以及作为参比电极的Ag/AgCl电极；所述的电解液为以硫堇为电化学探针的醋酸盐缓冲液。本发明专利技术利用四氧化三铁/还原氧化石墨烯的电化学信号放大作用和核酸适配体对底物的特异性结合作用，可以灵敏、准确、特异性地检测四环素。本发明专利技术制备的核酸适配体的生物传感器具有价格低廉、制备方法简单、试剂用量少、重现性好和稳定性好等优点。同时该方法也可应用于其它抗生素的检测，是一种有发展潜力的电化学测定方法，适用于食品安全中四环素的快速检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种食品安全领域的技术，具体是一种基于核酸适配体特异性检 测四环素的生物传感器及其制备方法。
技术介绍
抗生素被广泛用于人类医疗以及动物养殖中，用于防病治病、提高饲料利用率和 促进动物生长。四环素是一种常见的抗生素，具有良好的广谱抗菌性，被广泛应用于畜禽养 殖。我国是世界上四环素类抗生素生产、销售大国，抗生素的使用不合理及滥用导致其在动 物性食品和环境中的药物残留。目前，常见致病菌对四环素类耐药现象严重，对生态系统和 人类健康构成严重威胁。因此，研究快速、简便、经济、可靠的四环素快速检测技术具有重要 的现实意义。 传统的四环素测定方法主要有微生物法、酶联免疫法、薄层色谱法和液相色谱法。 尽管这些方法灵敏度高，但传统的四环素检测方法存在的显著弊端是检测耗时长、常需要 繁杂的前处理过程、较为昂贵的仪器设备以及专业的技术操作人员。因此，急需建立一种快 速、准确且特异性高的四环素残留检测方法。 经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN104931553A，公开（公告）日 2015. 09. 23,公开了一种基于丝网印刷电极的四环素适配体传感器制备及检测方法，将离 子液和四氧化三铁逐层修饰到丝网印刷电极表面常温下静置至干燥，然后四环素适配体固 定到经上述纳米材料修饰的丝网印刷电极表面。但该技术电极的修饰过程需要三个步骤， 操作步骤越繁琐，影响因素越多，并且耗时也更长。再者，该技术实施过程中使用离子液体， 用于制备离子液体的吡啶类原料是挥发性有机物，且离子液体的再生过程是采用具有挥发 性的传统有机溶剂进行萃取的过程。已有研究表明，离子液体具有潜在的毒性，对生物体以 及生态环境存在潜在危害。 陈丹、姚冬生、谢春芳、刘大岭在《中国生物工程杂志》上公开了一种"四环素核 酸适配体电化学生物传感器的研制"，其利用等温滴定量热法筛选到的四环素核酸适配体 做识别分子制作生物传感器，用电化学方法研究了该生物传感器检测四环素的电化学行 为。结果：等温滴定量热法筛选出一条对四环素有高亲和力的适配体，解离平衡常数Kd= 51. 8ymol/L。差分脉冲伏安分析，在5. 0~5.OXIO3yg/L浓度范围内，峰电流值的变化 AIp与四环素浓度的对数呈现良好的线性关系，相关系数R2= 0. 9876,检测限为I. 0yg/ L，反应时间为15min。该检测限明显低于目前国家限定的四环素残留量（6.OXIO2yg/L)， 也低于目前其他报道的四环素适配体传感器的检测限。但该技术采用的普通固体电极，每 次使用前均需要打磨、活化、清洗等前处理步骤，费时费力，且预处理后电极的均一性难以 保证。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于核酸适配体特异性检测四环 素的生物传感器及其制备方法。 本专利技术是通过以下技术方案实现的： 本专利技术涉及一种基于核酸适配体特异性检测四环素的生物传感器，该生物传感器 的丝网印刷电极的工作电极上依次修饰有四氧化三铁/还原氧化石墨烯-海藻酸钠复合物 层和四环素核酸适配体层。 本专利技术涉及上述生物传感器的制备方法，包括以下步骤： 1)将四氧化三铁/还原氧化石墨烯超声分散在海藻酸钠水溶液中，得到均一的四 氧化三铁/还原氧化石墨烯-海藻酸钠复合物； 所述的四氧化三铁/还原氧化石墨烯，即具有空心半球结构的四氧化三铁纳米颗 粒均匀生长在还原氧化石墨烯片表面形成的一种纳米复合物，具体通过以下方式得到： I. 1)将氧化石墨烯、表面活性剂P123和/或F127,超声分散到溶剂中； 1. 2)将可溶性铁盐和可溶性有机盐加入到上述溶液中，充分搅拌均匀后得到； 所述的溶剂为乙二醇、乙醇和水中的至少一种； 所述的可溶性铁盐为氯化铁、硝酸铁、硫酸铁中的一种或几种混合。 所述的可溶性有机盐为乙酸钠和/或乙酸钾。 2)将四氧化三铁/还原氧化石墨烯-海藻酸钠复合物修饰到丝网印刷电极的工作 电极表面，室温下干燥成膜； 所述丝网印刷电极的工作电极的材质为碳； 3)将四环素核酸适配体涂布在修饰有四氧化三铁/还原氧化石墨烯-海藻酸钠复 合物的工作电极表面，室温下干燥成膜后清洗即得。 所述的四环素核酸适配体，即76 -mer的核苷酸序列如SeqIDNo. 1所示，具体 为： 5r-CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGATCCG AGCTCCACGTG- 3，。 本专利技术涉及上述生物传感器的四环素检测方法，包括以下步骤： 1)将所得生物传感器在不同浓度待检测四环素溶液中孵育50min，清洗； 2)以四环素核酸适配体修饰电极作为工作电极，碳电极为对电极，Ag/AgCl电极 为参比电极，组成三电极体系； 3)将三电极体系置于含有I.Ommol/L硫堇的0?lmol/L、pH6. 0醋酸盐缓冲液中， 采用差分脉冲伏安法检测生物传感器在四环素溶液中孵育前后电化学信号的变化，即实现 四环素的检测。 所述的差分脉冲伏安法中，电位设置为_ 0. 5V到-0.IV，脉冲宽度为0. 05V，扫描 速率为0. 5s。 技术效果 与现有技术相比，本专利技术通过在丝网印刷电极上首先修饰四氧化三铁/还原氧化 石墨烯-海藻酸钠复合物，四氧化三铁/还原氧化石墨烯具有良好的导电性、催化活性和较 大的比表面积，能促进电极表面电子转移，且海藻酸钠具有较好的生物相容性与成膜性，能 很好地吸附固定生物活性物质并保持其活性。在检测过程中，修饰到电极上的四环素核酸 适配体在电极表面会发生自折叠。当检测体系中存在四环素时，修饰的四环素核酸适配体 与四环素特异性结合，四环素插入到核酸适配体自折叠的高级结构区域，核酸适配体在电 极界面的状态发生改变，空间位阻减少，降低氧化还原探针与电极界面的电阻，促进电子传 递，随着四环素浓度的增加，界面电子传递也加快，从而实现对四环素的定量检测。 本专利技术利用修饰的四环素核酸适配体与四环素特异性结合，导致电极表面电化学 信号的变化，从而实现对四环素的检测。将前述的四环素核酸适配体修饰电极作为工作电 极，碳电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，组成三电极体系，在含有硫堇的醋酸盐缓冲 液中，采用差分脉冲伏安法检测目标物质孵育前后电化学信号的变化，即可定量检测待测 目标物。 本专利技术采用的四氧化三铁/还原氧化石墨烯具有较好的信号放大作用，制备的核 酸适配体生物传感器灵敏度高、检测速度快、特异性高，并且操作简便、成本低廉，可以弥补 现有四环素检测方法的缺陷与不足。 本专利技术的有益效果进一步包括： 1)本专利技术采用的四氧化三铁/还原氧化石墨烯-海藻酸钠复合物不仅生物相容性 好，而且具有较好的信号放大作用，极大地提高检测四环素的性能； 2)本专利技术使用丝网印刷电极，其电极简便、小型化、易携带，且使用前无需任何预 处理； 3)本专利技术制备方法简单、性能稳定、成本低、试剂用量少，适用于食品安全中四当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于核酸适配体特异性检测四环素的生物传感器，其特征在于，该生物传感器的丝网印刷电极的工作电极上依次修饰四氧化三铁/还原氧化石墨烯‐海藻酸钠复合物层和四环素核酸适配体层。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周培，詹学佳，詹深山，初少华，徐涵楚，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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