基于核酸内切酶特异性识别的细胞分选系统技术方案

本发明专利技术涉及一种基于核酸内切酶特异性识别的细胞分选系统，所述的分选系统包含以下组分：第一单链核苷酸、第二单链核苷酸、抗体、细胞分选介质、限制性内切酶；所述的第一单链核苷酸和第二单链核苷酸互补，且互补区域含有所述限制性内切酶的识别位点；所述的第一单链核苷酸、第二单链核苷酸、抗体、细胞分选介质均被修饰，修饰后的第一单链核苷酸可与修饰后的抗体相连接，修饰后的第二单链核苷酸可与修饰后的细胞分选介质相连接。本发明专利技术还提供了利用上述系统分选细胞的方法，从细胞样品中分选DC细胞、NK细胞和CIK细胞的试剂盒及方法。本发明专利技术的细胞分选技术实现了同时分选多种细胞，可进行大量及脆弱细胞的分选，细胞得率和存活率高。

【技术实现步骤摘要】
基于核酸内切酶特异性识别的细胞分选系统
本专利技术涉及生物医药
，具体地说，涉及一种基于核酸内切酶特异性识别的细胞分选系统。
技术介绍
现有的细胞分选技术主要有以下两种：①流式细胞分离技术通过分离含有单细胞的液滴而实现的。将待测细胞与单克隆抗体和荧光染料结合后制成悬浮标本，在一定气体压力下样品进入流动室，在不含细胞的缓冲液包裹下单行排列。在流动室的超高频的压电晶体的高频振荡下，液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就包含在液滴之中。将这些液滴充上正或负电荷，当带电液滴通过电场，在电场的作用下发生偏转，然后落入相应的收集器之中，从而实现细胞分选。②免疫磁珠技术磁珠表面包被具免疫反应性的抗体，与细胞表面的抗原进行特异性结合；后者置于强大的磁场下，就会与未结合的细胞分开；脱离磁场后会立即消失磁性，这样就可以筛选或去除所标记的细胞，从而达到筛选出阳性或阴性细胞的目的。其流程图如图1所示。以上技术存在以下不足：流式细胞分离技术虽然可以分选得到目的细胞，但是①细胞必须能被荧光分子标记；②只能检测悬浮的单细胞；③分选过程不够温和，对细胞伤害大；④可能污染细胞；⑤不利于大体积样品的分选。免疫磁珠分选技术虽然可以通过正、负两种筛选获得目的细胞，但是①无法完成“一次结合”分离多种细胞；②如果需要从一个样品里面筛选多个目的细胞，需要多次结合和洗脱，得到的细胞活性差、得率低；③多次分选，成本高；④目的细胞与磁珠不能完全分离，不利于后续研究。目前关于对细胞伤害小、可同时分选多种细胞、获得的目的细胞能够与载体彻底分离，适用于大量及脆弱细胞分选的技术还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于核酸内切酶特异性识别的细胞分选系统。本专利技术的再一的目的是，提供一种从细胞样品中分选目的细胞的方法。本专利技术的另一的目的是，提供一种分选DC细胞、NK细胞和CIK细胞的试剂盒。本专利技术的第四个目的是，提供一种从细胞样品中分选DC细胞、NK细胞和CIK细胞的方法。为实现上述第一个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种基于核酸内切酶特异性识别的细胞分选系统，所述的分选系统包含以下组分：第一单链核苷酸、第二单链核苷酸、抗体、细胞分选介质、限制性内切酶；所述的第一单链核苷酸和第二单链核苷酸互补，且互补区域含有所述限制性内切酶的识别位点；所述的第一单链核苷酸、第二单链核苷酸、抗体、细胞分选介质均被修饰，修饰后的第一单链核苷酸可与修饰后的抗体相连接，修饰后的第二单链核苷酸可与修饰后的细胞分选介质相连接。其中，所述的第一单链核苷酸和第二单链核苷酸为部分序列互补或完全互补。优选地，所述的第一单链核苷酸或第二单链核苷酸的长度为6bp-1kb。更优选地，所述的第一单链核苷酸或第二单链核苷酸的长度为18bp-50bp。优选地，所述的细胞分选介质是磁珠、分离柱或聚阳离子纳米颗粒。更优选地，所述的第一单链核苷酸被巯基修饰，所述的第二单链核苷酸被生物素修饰，所述的抗体被顺丁烯二酰亚胺修饰，所述的磁珠被链霉亲和素修饰。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种从细胞样品中分选目的细胞的方法，所述的方法包括以下步骤：a)合成互补的单链核苷酸，制备“磁珠/单链核苷酸”和“抗体/单链核苷酸”复合物；b)在细胞样品中加入“抗体/单链核苷酸”复合物，形成“单链核苷酸/抗体/细胞”复合物；c)将“磁珠/单链核苷酸”复合物加入到“单链核苷酸/抗体/细胞”复合物中，形成“磁珠/双链核苷酸/抗体/细胞”复合物；d)通过外加磁场的作用，磁性吸附目的细胞，去除非目的细胞；e)针对不同的目的细胞，每次使用不同的限制性内切酶剪切含有特定识别序列的双链核苷酸，逐次洗脱不同的目的细胞。优选地，步骤b)中细胞样品的体积、细胞样品中目的细胞个数、目的细胞对应的抗体质量的比例为：1mL细胞样品∶106-109个目的细胞∶5-100μg目的细胞对应的抗体。优选地，步骤c)中所述的“单链核苷酸/抗体/细胞”复合物与“磁珠/单链核苷酸”复合物的个数比为1:5-1:100。优选地，步骤b)反应条件为2-8℃，5-30min。优选地，步骤c)反应条件为15-25℃，5-30min。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种分选DC细胞、NK细胞和CIK细胞的试剂盒，所述的试剂盒包含以下组分：巯基与生物素修饰的三对单链核苷酸，CD3、CD56和HLA-DR抗体，链霉亲和素磁珠，限制性内切酶BamHI、EcoRI、HindIII。优选地，所述的三对单链核苷酸的序列分别如SEQIDNO.1-SEQIDNO.6所示。为实现上述第四个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种从细胞样品中分选DC细胞、NK细胞和CIK细胞的方法，它包括以下步骤：a)合成三对互补的单链核苷酸，制备三种“磁珠/单链核苷酸”和三种“抗体/单链核苷酸”复合物，所述的抗体分别为CD3、CD56和HLA-DR抗体，所述的三对单链核苷酸片段的序列分别如SEQIDNO.1-SEQIDNO.6所示；b)在细胞样品中加入三种“抗体/单链核苷酸”复合物，形成“单链核苷酸/抗体/细胞”复合物；c)将三种“磁珠/单链核苷酸”复合物加入到“单链核苷酸/抗体/细胞”复合物中，形成“磁珠/双链核苷酸/抗体/细胞”复合物；d)通过外加磁场的作用，分离获得与磁珠结合的细胞；e)针对不同的目的细胞，分别使用限制性内切酶BamHI、EcoRI、HindIII逐次洗脱。优选地，步骤b)中细胞样品的体积、细胞样品中目的细胞个数、目的细胞对应的抗体质量的比例为：1mL细胞样品∶106-109个目的细胞∶5-100μg目的细胞对应的抗体。优选地，步骤c)中所述的“单链核苷酸/抗体/细胞”复合物与“磁珠/单链核苷酸”复合物的个数比为1:5-1:100。优选地，步骤b)反应条件为2-8℃，5-30min。优选地，步骤c)反应条件为15-25℃，5-30min。本文中，所述的“细胞分选介质”包含所有用于分选细胞的介质，例如磁珠、分离柱、聚阳离子纳米颗粒等其他可以达到分选目的的介质。所述的第一单链核苷酸、第二单链核苷酸、抗体、细胞分选介质的修饰方式并不限于以上内容记载的方式，任何可以使这些分子结合的方式都是可以接受的。本专利技术优点在于：本专利技术在常规细胞分选技术的基础上引入了两种特异性识别机制(限制性内切酶对双链核苷酸序列的特异性识别、抗体与抗原的特异性识别)，实现一次吸附再多次分离得到多种目的产物。本专利技术的细胞分选技术可以弥补现有技术的不足，与流式细胞技术相比对细胞伤害小；与免疫磁珠技术相比，可同时分选多种细胞，且获得的目的细胞能够与细胞分选介质分离，因而细胞可用于再次分选。本专利技术的技术可进行大量及脆弱细胞的分选，细胞得率和存活率高。本专利技术的技术在细胞分选基础上，可作为细胞治疗中的配套技术，为细胞治疗提供高纯度、有活力的细胞，也可用于检测分析领域，与微量的核酸检测设备联合使用，对不同的目标物进行定量检测。其为临床诊断、细胞分离、检测、细胞疗法等领域带来福音。附图说明图1是免疫磁珠分选技术的原理与流程图。图2是本专利技术基于核酸内切酶特异性识别的细胞分选系统的原理与流程图。图3是单链核苷酸与抗体通过Thiol/Malemide结合示意图。Ab：抗体；Oligo：单链核苷酸；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于核酸内切酶特异性识别的细胞分选系统，其特征在于，所述的分选系统包含以下组分：第一单链核苷酸、第二单链核苷酸、抗体、细胞分选介质、限制性内切酶；所述的第一单链核苷酸和第二单链核苷酸互补，且互补区域含有所述限制性内切酶的识别位点；所述的第一单链核苷酸、第二单链核苷酸、抗体、细胞分选介质均被修饰，修饰后的第一单链核苷酸可与修饰后的抗体相连接，修饰后的第二单链核苷酸可与修饰后的细胞分选介质相连接。

【技术特征摘要】
1.一种基于核酸内切酶特异性识别的细胞分选系统，其特征在于，所述的分选系统包含以下组分：第一单链核苷酸、第二单链核苷酸、抗体、细胞分选介质、限制性内切酶；所述的第一单链核苷酸和第二单链核苷酸互补，且互补区域含有所述限制性内切酶的识别位点；所述的第一单链核苷酸以巯基修饰，第二单链核苷酸以生物素修饰，抗体以顺丁烯二酰亚胺修饰，细胞分选介质以链霉亲和素修饰，巯基修饰后的第一单链核苷酸与经顺丁烯二酰亚胺修饰的抗体相连接，生物素修饰后的第二单链核苷酸与经链霉亲和素修饰的细胞分选介质相连接。2.根据权利要求1所述的分选系统，其特征在于，所述的第一单链核苷酸或第二单链核苷酸的长度为6bp-1kb。3.根据权利要求1所述的分选系统，其特征在于，所述的细胞分选介质为磁珠、分离柱或聚阳离子纳米颗粒。4.一种从细胞样品中分选目的细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：a)合成互补的单链核苷酸，所述互补的单链核苷酸由互补的第一单链核苷酸和第二单链核苷酸组成，巯基修饰第一单链核苷酸，生物素修饰第二单链核苷酸，且互补区域含有限制性内切酶的识别位点，将所述经生物素修饰的第二单链核苷酸与经链霉亲和素修饰的磁珠制备为“磁珠/单链核苷酸”复合物，将所述经巯基修饰第一单链核苷酸与经顺丁烯二酰亚胺修饰的抗体制备为“抗体/单链核苷酸”复合物；b)在细胞样品中加入“抗体/单链核苷酸”复合物，形成“单链核苷酸/抗体/细胞”复合物；c)将“磁珠/单链核苷酸”复合物加入到“单链核苷酸/抗体/细胞”复合物中，形成“磁珠/双链核苷酸/抗体/细胞”复合物；d)通过外加磁场的作用，磁性吸附目的细胞，去除非目的细胞；e)针对不同的目的细胞，每次使用不同的限制性内切酶剪切含有特定识别序列的双链核苷酸，逐次洗脱不同的目的细胞。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤b)中细胞样品的体积、细胞样品中目的细胞个数、目的细胞对应的抗体质量的比例为：1mL细胞样品∶106-109个目的细胞∶5-100μg目的细胞对应的抗体；步骤c)中所述的“单链核苷酸/抗体/细胞”复合物与“磁珠/单链核苷酸”复合物的个数比为1:5-1:100。6.一种分选DC细胞、NK细胞和CIK细胞的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含以下组分：三对单链核苷酸，经顺丁烯二酰亚胺修饰的CD3、CD56和HL...

【专利技术属性】
技术研发人员：蓝田，J·盖茨，郑敦武，
申请(专利权)人：赛业苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32