一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统及其应用，所述测试系统包括：(1)用于表达sgRNA的质粒；(2)用于表达Cas9的质粒；(3)用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告系统；所述报告系统是将能够编码有效蛋白的核苷酸片段的C-端与报告基因的N-端拼接，拼接处插入两个限制性核酸内切酶酶切位点；在利用CRISPR/Cas9系统编辑(敲除)特定基因之前，靶序列的选择至关重要，这个选择会影响sgRNA对目的DNA的识别效率、与目的DNA的结合效率、Cas9的靶向切割效率和NHEJ修复效率，利用本系统可定量比较不同sgRNA–靶DNA序列的基因编辑效率，可以在短时间内确定工作效果最佳的sgRNA，提高实际敲除的成功率，这不仅可以降低工作成本，还可以提高工作效率，推动工作进程。

【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种CRISPR/Cas9工作效率测试系统及其应用，可在细胞水平上快速、简便、准确测试由CRISPR/Cas9sgRNA介导的基因编辑效率，筛选可有效用于基因编辑(敲除、突变、敲入)的sgRNA。(二)
技术介绍
成簇的、规律间隔的短回文重复序列CRISPR(ClusteredRegularlyInterspersedShortPalindromicRepeats)是目前最高效的基因组编辑系统，是从一种来自细菌及古细菌中降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制改造而来。它包含三个元件：Cas9蛋白、crRNA(CRISPR-associatedRNA)和tracrRNA(trans-activatingcrRNA)。含有两个核酸酶结构域(RuvC和HNH)的Cas9蛋白首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过识别和结合靶DNA的PAM(protospaceradjacentmotif)基序(5’-NGG-3’)，解旋靶DNA，通过crRNA中的含20碱基的小向导RNA(sgRNA)与单链靶DNA碱基配对，形成RNA-DNA复合结构，进而利用Cas9RuvC和HNH核酸酶各自切割靶DNA的一条链，形成带有平末端的DNA双链断裂。断裂的DNA要么修复，以保证细胞成活；要么不修复，从而导致细胞死亡。在包括人类细胞的真核细胞中，Cas9诱导的DNA双链断裂主要由细胞内两条保守途径修复：同源重组(homologousrecombination；HR)和非同源末端连接(non-homologousend-joining；NHEJ)。NHEJ会产生删除、插入，导致基因变异，甚至失活移码，从而编辑或敲除目的基因。如果能够提供外源同源序列，HR则可以在选定的DNA靶位上、依照基因靶向原理嵌入目的基因或DNA片段。由于PAM基序结构简单(5’-NGG-3’)，几乎可以在所有的基因中都能找到大量靶点，利用Cas9诱导的DNA双链断裂及随后的修复，可以通过这些靶点有效敲除目的基因或者嵌入目的基因或基因片段，因此CRISPR/Cas9技术在基因编辑中潜力巨大，在短短的时间内就已得到了广泛的应用。目前，CRISPR/Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，在生物、农业、医学等领域具有巨大的应用潜力和经济效益。CRISPR/Cas9基因编辑系统的工作效率主要取决于Cas9的靶向切割效率，而这个靶向切割效率很大程度上依赖于sgRNA对目的DNA靶位的识别能力和亲和力。在CRISPR/Cas9技术应用中，sgRNA对靶的识别能力差、与目的DNA的靶位亲和力低或Cas9的切割效率低下都会降低CRISPR/Cas9的工作效率，并且可能提高sgRNA介导的脱靶，严重限制了CRISPR/Cas9的实际应用，特别是当这个技术被用到生物医学领域。因此，如果能够快速测试sgRNA介导的Cas9的靶向切割效率及随后的基因编辑效率，将大大提高CRISPR/Cas9的实际应用效率，降低CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用成本，推动CRISPR/Cas9基因编辑技术的成功的和广泛的应用。目前，测试sgRNA脱靶倾向的一个常用方法是通过计算机估算sgRNA在基因组的其它部位的错配比重，比如，张锋实验室的计算机测试方法(www.crispr.mit.edu)，但这个方法并不考虑sgRNA在其真正靶位的工作效率，也无实际测试。另外的一个方法是通过测量sgRNA实际应用后的基因编辑效率来返回评估，但这耗时耗力，也未达到测试效果。第三种方法是设计一个基于萤火虫荧光素酶(Fireflyluciferase；FLuc)基因的报告系统，比如北京百奥赛图基因生物技术有限公司的CRISPR/Cas9活性检测试剂盒。在这个报告系统中，FLuc基因因人为插入两段重复序列而失活。为了测试sgRNA介导的基因编辑效率，在两段重复序列之间嵌入靶基因片段，然后将带有靶基因片段的报告系统、Cas9表达质粒和需测试的sgRNA表达质粒同时转入细胞，利用sgRNA介导Cas9的靶向切割，断裂的靶基因片段将通过两边的重复序列完成单链退火(singlestrandanealing，SSA)修复，恢复正常的FLuc基因。转染后2-3天，通过测量细胞内FLuc活性，可以判断sgRNA介导的CRISPR工作效率。但是，由于这个报告系统中断裂的DNA是通过特殊的、由重复序列介导的SSA来修复，而不是CRISPR技术所利用的HR和NHEJ，因此，这个方法所测试的并不是真正的基因编辑效率，也不能准确地测试sgRNA的优劣，而且选定的靶基因片段需要克隆或扩增获取。因此，该领域急需一个更准确、有效、简便、快速的能测试sgRNA工作效率及CRISPR/Cas9基因编辑效率的测试系统。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是构建、测试、验证了一种在细胞水平上能准确、有效、简便、快速检测sgRNA工作效率及CRISPR/Cas9基因编辑效率的检测系统，为个体化或高通量设计和选择高效的CRISPR/Cas9sgRNA序列提供可靠的核心技术基础。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统，所述测试系统包括：(1)用于表达sgRNA的质粒；(2)用于表达Cas9的质粒；(3)用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告系统；所述报告系统是将能够编码有效蛋白的核苷酸片段的C-端与报告基因的N-端拼接，拼接处插入两个限制性核酸内切酶酶切位点。进一步，所述能够编码有效蛋白的核苷酸片段为灭瘟素脱氨酶基因BSD(BlasticidinSdeaminase；BSD)、新霉素抗性基因、蓝色荧光蛋白基因、β-半乳糖苷酶基因或酪氨酸酶基因。进一步，所述报告基因为用于检测的有活性的酶基因或可发光的蛋白基因，优选所述报告基因为下列之一：绿色荧光蛋白基因GFP、黄色荧光蛋白基因YFP、青色荧光蛋白基因CFP、蓝色荧光蛋白基因BFP、红色荧光蛋白基因RFP、水母发光蛋白基因、克林霉素基因、萤火虫荧光素酶基因(fireflyluciferase；FLuc)、β-半乳糖苷酶基因或酪氨酸酶基因，最优选绿色荧光蛋白基因GFP或萤火虫荧光素酶基因FLuc。进一步，所述限制性核酸内切酶酶切位点包括I-SceI、EcoRI，KpnI或BamHI等，优选下列之一：I-SceI(18个碱基对)、EcoRI，KpnI或BamHI。进一步，所述报告系统是将灭瘟素脱氨酶基因BSD的C-端与绿色荧光蛋白基因GFP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统，其特征在于所述测试系统包括：(1)用于表达sgRNA的质粒；(2)用于表达Cas9的质粒；(3)用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告系统；所述报告系统是将能够编码有效蛋白的核苷酸片段的C‑端与报告基因的N‑端拼接，拼接处插入两个限制性核酸内切酶酶切位点。

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统，其特征在于所述测试系统包括：(1)用于
表达sgRNA的质粒；(2)用于表达Cas9的质粒；(3)用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报
告系统；所述报告系统是将能够编码有效蛋白的核苷酸片段的C-端与报告基因的N-端拼
接，拼接处插入两个限制性核酸内切酶酶切位点。
2.如权利要求1所述CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统，其特征在于所述能够编码有
效蛋白的核苷酸片段为灭瘟素脱氨酶基因、新霉素抗性基因、蓝色荧光蛋白基因、β-半乳糖
苷酶基因或酪氨酸酶基因。
3.如权利要求1所述CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统，其特征在于所述报告基因为
用于检测的有活性的酶基因或可发光的蛋白基因。
4.如权利要求3所述CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统，其特征在于所述报告基因为
下列之一：绿色荧光蛋白基因GFP、黄色荧光蛋白基因YFP、青色荧光蛋白基因CFP、蓝色荧光
蛋白基因BFP、红色荧光蛋白基因RFP、水母发光蛋白基因、克林霉素基因、萤火虫荧光素酶
基因FLuc、β-半乳糖苷酶基因或酪氨酸酶基因。
5.如权利要求1所述CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统，其特征在于所述限制性核酸
内切酶酶切位点为下列之一：I-SceI、EcoRI、KpnI或BamHI。
6.如权利要求1所述CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统，其特征在于所述报告系统是
将灭瘟素脱氨酶基因的C-端与绿色荧光蛋白基因GFP的N-端拼接，拼接处插入两个限制性
核酸内切酶酶切位点；所...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢安勇，郭涛，冯依力，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33