一种植物瞬时表达植物DNA错配识别的核酸内切酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种植物瞬时表达植物DNA错配识别的核酸内切酶的方法。本发明专利技术的方法包括如下步骤：在烟草叶片中表达植物DNA错配识别的核酸内切酶，再从表达植物DNA错配识别的核酸内切酶的烟草叶片中提取植物DNA错配识别的核酸内切酶。通过实验证明：本发明专利技术采用烟草瞬时表达系统，可以高效表达外源蛋白酶CELI，从注射农杆菌到纯化蛋白仅需3-5天时间，大大节约时间和成本，并且酶活并没有降低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物瞬时表达植物DNA错配识别的核酸内切酶的方法，属于生物

技术介绍
植物DNA错配识别的核酸内切酶(Recognizing DNA Mismatch Specific endonucleases in plants)是一种单链、双链都特异识别的特异性核酸酶(Pimkin et al,2007)，mung bean nuclease、SP1、S1、P1、ZEN1、ZEN2、CEL I、CEL II、M1、BENI、T7Endonuclease I、Endo V或T4Endonuclease VII等具有同源性(图7和图8)的核酸内切酶都属于植物DNA错配识别的核酸内切酶(Till et al,2004；Pimkin et al,2007)。传统理论认为该酶的催化活性只需要Mg2+和Zn2+(Till et al,2004)，它可以识别八种错配形式的碱基(mismatches)分别为AA、AG、AC、GG、GT、CC、CT和TT(Oleykowski et al,1999；Oleykowski et al,1998)，因此被广泛应用于突变检测领域，如植物TILLING技术平台中(Colbert et al,2001；Till et al,2006)。它可以特异性切割错配碱基(Yang et al,1999)。通过酶切扩增的目标检测片段，并经琼脂糖或毛细管电泳分离检测(Jiang et al,2013)，一般可方便获得突变位置和大小。因此，它是一种比较方便和经济的检测未知和已知突变位点的手段(Yeung et al,2005)。目前CELI酶主要提取途径是从芹菜中提取，主要提取方法是硫酸铵沉淀法，得到的粗提酶液一般可直接用于检测(Till et al,2006)。如果需要得到纯度更高的酶，需要经过刀豆体蛋白A-琼脂糖柱吸附(Pimkin et al,2007)，用alpha-甘露糖苷洗脱，但是得率较低(Yang et al,1999)。因此，大部分TILLING突变体检测实验是用粗提酶来检测的，该粗提酶的主要成分即为CELI酶。由于CELI酶为糖基化修饰酶，故不能在原核细胞中表达(Yang et al,1999)。因此，Maxim Pimkin等人用昆虫细胞系Sf9细胞系得到重组的CEL I酶(Pimkin et al,2007)，但是该方法成本较高、周期较长，实验条件苛刻。此外，目前商业化的CEL I和CEL II都需要依赖进口，由于冷链运输价格昂贵，导致其未广泛在国内使用。早在上世纪八十年代人们就开始在植物中表达重组蛋白，并且广泛地应用在医学制药领域(Buyel et al,2014)。植物细胞不仅仅能够表达一般外源蛋白，当然还包括医用抗体等产品(Rodr guez et al,2004)。因此转基因植物表达外源蛋白是一种不可或缺的方法，相比其他动物，如昆虫细胞，它既经济而且可以大规模种植来用于生产。传统的重组外源蛋白方法主要依赖于稳定的转基因植株，它不仅耗时并且受资源、空间的限制。相比而言，植物瞬时表达法是一种在几天内非常快速产生大量外源活性蛋白
的方法，并且能够迅速满足商业化产品的生产要求(Sainsbury et al,2014)。一般来说这种系统表达的蛋白量的高低，主要受mRNA密码子选择及GC含量、表达载体的框架结构、寄主细胞、培养条件等影响(Ullrich et al,2015)。植物瞬时表达能够在农杆菌浸染后2-4天内迅速表达至最高水平(Lacroix et al,2013)。而稳定的表达体系需要T-DNA整合至目标的基因组，在浸染农杆菌10-14天后，才有选择性地提高表达水平(Janssen et al,1990)。间接的证据表明瞬时表达中的外源T-DNA拷贝在表达外源蛋白时占主要的作用，而非整合至植物基因组中再发挥作用(Lacroix et al,2013；et al,2015)。烟草作为植物界的“小白鼠”，被作为反应器的主要物种(Lacroix et al,2013)，主要是由于烟草的叶片量多，非常适合表达外源蛋白。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种植物DNA错配识别的核酸内切酶(Recognizing DNA Mismatch Specific endonucleases in plants)的制备方法。本专利技术提供的植物DNA错配识别的核酸内切酶的制备方法包括如下步骤：在烟草叶片中表达植物DNA错配识别的核酸内切酶，再从表达植物DNA错配识别的核酸内切酶的烟草叶片中提取植物DNA错配识别的核酸内切酶。上述方法中，所述在烟草叶片中表达植物DNA错配识别的核酸内切酶，再从表达植物DNA错配识别的核酸内切酶的烟草叶片中提取植物DNA错配识别的核酸内切酶的方法包括如下步骤：将所述植物DNA错配识别的核酸内切酶的编码基因导入农杆菌，得到重组菌；再用所述重组菌侵染烟草外植体，得到侵染后烟草外植体；再从所述侵染后烟草外植体中提取所述植物DNA错配识别的核酸内切酶，得到植物DNA错配识别的核酸内切酶。上述方法中，所述植物DNA错配识别的核酸内切酶的编码基因是通过重组表达载体导入所述农杆菌的。上述方法中，所述侵染的方法为将所述重组菌注射到所述烟草叶片下表皮。上述方法中，所述重组表达载体为将所述植物DNA错配识别的核酸内切酶的编码基因插入表达载体中得到的载体。上述方法中，所述外植体为非子叶叶片；所述目的农杆菌为农杆菌EH105。上述方法中，所述植物DNA错配识别的核酸内切酶为mung bean nuclease、SP1、S1、P1、ZEN1、ZEN2、CEL I、CEL II、M1、BENI、T7Endonuclease I、Endo V或T4Endonuclease VII；所述植物DNA错配识别的核酸内切酶具体为CELI。上述方法中，所述CELI酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列3的第65-958位。上述方法中，所述表达载体为pCambia 2300-GFP(N)或pCambia 2300-GFP(C)。本专利技术的另一个目的是提供由上述方法制备得到的植物DNA错配识别的核酸内切酶。上述植物DNA错配识别的核酸内切酶在切割含有错配位点DNA中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术采用烟草瞬时表达系统，高效表达外源CEL I酶。通过实验证明：本专利技术的表达系统从注射农杆菌到纯化蛋白仅需3-5天时间，大大节约时间和成本，并且酶活并没有降低。附图说明图1为重组载体pCambia2300-CELI-His的示意图。图2为重组载体pCambia2300-GFP-CELI-His的示意图。图3为烟草注射农杆菌后，重组载体pCambia2300-CELI-His的表达情况。左侧为含有空载体的重组菌；右侧为含有重组载体pCambia2300-GFP-CELI-His的重组菌。图4为重组CELI-GFP的SDS-PAGE图。图5为CELI-His注射农杆菌后，不同天数表达情况。图6为重组CELI-GFP和CELI-His(外源CELI)与内源CELI比较。泳道1为内源CELI对野生型DNA的酶切结果；泳道2为重组CELI-GFP对突变体DNA的酶切结果；泳道3为C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物DNA错配识别的核酸内切酶的制备方法，包括如下步骤：在烟草叶片中表达植物DNA错配识别的核酸内切酶，再从表达植物DNA错配识别的核酸内切酶的烟草叶片中提取植物DNA错配识别的核酸内切酶。

【技术特征摘要】
1.一种植物DNA错配识别的核酸内切酶的制备方法，包括如下步骤：在烟草叶片中表达植物DNA错配识别的核酸内切酶，再从表达植物DNA错配识别的核酸内切酶的烟草叶片中提取植物DNA错配识别的核酸内切酶。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述在烟草叶片中表达植物DNA错配识别的核酸内切酶，再从表达植物DNA错配识别的核酸内切酶的烟草叶片中提取植物DNA错配识别的核酸内切酶的方法包括如下步骤：将所述植物DNA错配识别的核酸内切酶的编码基因导入农杆菌，得到重组菌；再用所述重组菌侵染烟草外植体，得到侵染后烟草外植体；再从所述侵染后烟草外植体中提取所述植物DNA错配识别的核酸内切酶，得到植物DNA错配识别的核酸内切酶。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述植物DNA错配识别的核酸内切酶的编码基因是通过重组表达载体导入所述农杆菌的。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述侵染的方法为将所述重组菌注射到所述烟草叶片下表皮。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚学峰，刘春明，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11