双链核酸的合成制造技术
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及用于从多种样品合成双链核酸的方法并且包括这些核酸用于深度序列分析的用途。另外，本专利技术涉及用于本专利技术的方法中的特定试剂。此外，本专利技术涉及包含用于本专利技术的方法之试剂的试剂盒和所述试剂盒的用途。专利技术背景核酸的大规模平行测序(Massiveparallelsequencing，MPS)需要制备扩增文库，其中待测序的DNA区域位于已知的5’-和3’-末端序列之间。用于MPS文库构建的当前方法利用RNA或DNA接头(adaptor)连接到RNA或DNA样品的5’和3’末端。接头的连接不仅耗时，而且是需要以微克级输入(micrograminputs)核酸样品的低效率过程。此外，所得cDNA文库受到接头交叉和自我连接副产物污染，并且在预扩增之前和之后需要额外的纯化步骤。十多年前，Clontech实验室描述了利用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)的模板转换活性选择地将接头连接至由聚(A)加尾的mRNA分子产生cDNA的5’-末端的方法。同时，将3’-接头序列并入聚(dT)逆转录引物中。这种称为SMART的原理目前用于IlluminaUltr...
【技术保护点】
用于从包含单链核酸的样品合成具有限定的3’和5’端核苷酸序列的双链核酸的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供包含单链核酸或双链核酸的样品，任选地使所述双链核酸变性，b)向所述单链核酸或双链核酸的3’‑端添加至少5个连续的核苷酸，c)使与所添加核苷酸序列互补的引发寡核苷酸杂交并用模板依赖性DNA或RNA聚合酶合成cDNA或cRNA以产生双链核酸，d)使模板转换寡核苷酸与所述双链核酸杂交，以及e)使所述cDNA或cRNA链的3’末端延伸以合成双链核酸，其中所述核酸的一条链包含所述引发寡核苷酸以及与所述单链核酸和所述模板转换寡核苷酸互补的cDNA或cRNA。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.14 EP 14168313.61.用于从包含单链核酸的样品合成具有限定的3’和5’端核苷酸序列的双链核酸的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供包含单链核酸或双链核酸的样品，任选地使所述双链核酸变性，b)向所述单链核酸或双链核酸的3’-端添加至少5个连续的核苷酸，c)使与所添加核苷酸序列互补的引发寡核苷酸杂交并用模板依赖性DNA或RNA聚合酶合成cDNA或cRNA以产生双链核酸，d)使模板转换寡核苷酸与所述双链核酸杂交，以及e)使所述cDNA或cRNA链的3’末端延伸以合成双链核酸，其中所述核酸的一条链包含所述引发寡核苷酸以及与所述单链核酸和所述模板转换寡核苷酸互补的cDNA或cRNA。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是液体或固体活检样品或由其来源，更优选血液样品、血浆样品、血清样品、体液样品、唾液样品、尿样品、精液样品、来自胸膜腔的流体样品、来自腹膜腔的流体样品、脑脊液的样品、来自上皮表面的涂片、痰样品、粪便样品、射精样品、泪液样品、汗液样品、淋巴液样品、支气管灌洗样品、胸腔积液样品、脑膜液样品、腺液样品、细针抽吸样品、微切割细胞、乳头抽吸液样品、脊髓液样品、结膜液样品、阴道液样品、十二指肠液样品、胰液样品或胆汁样品。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是从化石、灭绝生物体的残余物、植物、果实和动物、微生物、细菌或病毒获得的。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述单链核酸是DNA，优选片段化的和/或亚硫酸氢盐转化的DNA；或者RNA，优选miRNA、小RNA、piRNA或亚硫酸氢盐转化的RNA。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述连续的核苷酸是相同的，或由相同的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸或多核苷酸组成。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述连续的相同核苷酸选自A、T、G、C或U的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或双脱氧核糖核苷酸，或者选自两个或更多个核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸。7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中多核苷酸加尾反应是用两个或更多个核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的混合物进行的。8.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述相同的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或双脱氧核糖核苷酸通过选自以下的酶添加：聚(A)-聚合酶、聚(U)-聚合酶、聚(G)-聚合酶、末端转移酶、DNA连接酶、RNA连接酶；而二核苷酸和三核苷酸通过RNA连接酶添加。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述引发寡核苷酸包含以下核苷酸序列元件：3’-Wm-X-Yn-Z1o-Qt-Z2s-5‘，其中W在每种情况下独立地选自：dA、dG、dC、dT和dU；X选自：dA、dG、dC、dT、dU、rA、rG、rC、rT和rU；Y是至少10个核苷酸长度的多核苷酸，其中所述序列的80％或更多由选自以下的相同的核苷酸或二核苷酸构成：dA、dG、dC、dT、dU、rA、rG、rC、rT、rU、AC、AG、AT、AU、CA、CG、CT、CU、GA、GC、GT、GU、TA、TC、TG、TU、AA、CC、GG、TT、UU、UA、UC、UG和UT，其中所述序列的另外20％或更少由不同于主要核苷酸或二核苷酸并且也选自以下的核苷酸或二核苷酸构成：dA、dG、dC、dT、dU、rA、rG、rC、rT、rU、AC、AG、AT、AU、CA、CG、CT、CU、GA、GC、GT、GU、TA、TC、TG、TU、AA、CC、GG、TT、UU、UA、UC、UG和/或UT，前提条件是X不同于构成Y大部分的核苷酸或二核苷酸；Q是连续的简并(摆动)DNA碱基的序列，优选地选自N、V、H、D、B和J，其中N是并入来自dA、dT、dC和dG等摩尔混合物的核苷酸的产物；B是并入来自dT、dC和dG等摩尔混合物的核苷酸的产物；D是并入来自dA、dT和dG等摩尔混合物的核苷酸的产物；H是并入来自dA、dT和dC等摩尔混合物的核苷酸的产物；V是并入来自dA、dC和dG等摩尔混合物的核苷酸的产物，J是并入来自(0-100％dA)比(0-100％dG)比(0-100％dC)比(0-100％dT)比(0-100％dU)比(0-100％rA)比(0-100％rG)比(0-100％rC)比(0-100％rT)比(0-100％rU)的混合物的核苷酸的产物；Z1是限定序列的至少5个核苷酸长度的多核苷酸，其中所述序列不同于Wm-X-Yn，优选所述序列也不同于Qt-Z2s；Z2是限定序列的至少5个核苷酸长度的多核苷酸，其中所述序列不同于Wm-X-Yn-Z1o-Qt；m是0至6的整数，即0、1、2、3、4、5或6；如果Y选自dA、dG、dC、dT、dU、rA、rG、rC、rT和rU，则n是10至100的整数，如果Y选自AC、AG、AT、AU、CA、CG、CT、CU、GA、GC、GT、GU、TA、TC、TG、TU、AA、CC、GG、TT、UU、UA、UC、UG和UT，则n是5至50的整数；o是0或1；s是0或1；并且t是0至6的整数，即0、1、2、3、4、5或6。10.根据权利要求9所述的方法，其中Z1和/或Z2选自：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：19和SEQIDNO：20。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述模板转换寡核苷酸由下式表示5’-Xp-Y-Qt-Zq-Ar-3’其中X是选自氨基、生物素、甘油、胆固醇、地高辛、氟残基或核苷酸衍生物的化学基团，所核苷酸衍生物包括脱碱基核苷酸、双脱氧核糖核苷酸、3’-脱氧核苷酸、2’-脱氧肌苷、2’-脱氧尿苷；Y是已知的寡核苷酸序列；Q是连续的简并(摆动)DNA碱基的序列，优选地选自：N、V、H、D、B和J，其中N是并入来自dA、dT、dC和dG等摩尔混合物的核苷酸的产物；B是并入来自dT、dC和dG等摩尔混合物的核苷酸的产物；D是并入来自dA、dT和dG等摩尔混合物的核苷酸的产物；H是并入来自dA、dT和dC等摩尔混合物的核苷酸的产物；V是并入来自dA、dC和dG等摩尔混合物的核苷酸的产物，J是并入来自(0-100％dA)比(0-100％dG)比(0-100％dC)比(0-100％dT)比(0-100％dU)比(0-100％rA)比(0-100％rG)比(0-100％rC)比(0-100％rT)比(0-100％rU)混合物的核苷酸的产物；Z是选自AMP、CMP、GMP、TMP和UMP的核糖核苷酸，A是选自氨基、生物素、甘油、胆固醇、地高辛、磷酸/盐/酯、氟残基或核苷酸衍生物的化学基团，所述核苷酸衍生物包括脱碱基核苷酸、双脱氧核糖核苷酸、3’-脱氧核苷酸、2’-脱氧肌苷、2’-脱氧尿苷；t是0至6的整数，即0、1、2、3、4、5或6；p是0至10的整数，即0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；q是至少为1的整数；并且r是0至10的整数，即0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。12.根据权利要求1至11...
【专利技术属性】
技术研发人员：安德雷·图尔奇诺维奇，哈拉尔德·苏罗维，芭芭拉·伯温克尔，
申请(专利权)人：海德堡鲁普雷希特卡尔斯大学，德国癌症研究公共权益基金会，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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