用于聚合酶链式反应系统的新颖化合物及其应用技术方案

本公开涉及用于各种组合物、试剂盒以及方法的新颖化合物，包括(举例来说)用于聚合酶储存缓冲液和如聚合酶链式反应(PCR)的核酸合成或扩增反应中。还描述了制备该新颖化合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于各种组合物、试剂盒和方法的新颖化合物，包括(举例来说)在聚合酶储存缓冲液中或在如聚合酶链式反应(PCR)的反应中涉及核酸合成的组合物和方法。还描述了用于制备改性的化合物的方法。
技术介绍
许多公知的重组DNA技术涉及复制或聚合和/或扩增DNA。一个此类实例为聚合酶链式反应(PCR)。在PCR期间，该反应在热稳定DNA聚合酶存在下，在低温和高温(例如，55℃和95℃)两个温度之间反复地循环。在高温下在反应过程中耗费的总时间段取决于循环总数、每次循环的高温步骤持续时间和变温速度(即，热循环仪从一个温度改变到另一个温度下的速率)。尽管用于PCR的DNA聚合酶是高度热稳定的，但是它们在高温下随着时间推移倾向于变得失活。此外，这些聚合酶通过被引入到具有次最佳辅因子浓度或具有次最佳pH水平或包括化学或生物抑制剂的存在的反应混合物环境中也可变得失活。在此类条件下，稳定酶的一种方法为添加稳定剂，如表面活性剂。表面活性剂(如清洁剂)为使活性形式酶和其液体环境之间的界面稳定的表面活性化合物。举例来说，TaqDNA聚合酶的活性已通过添加如NP-40或20(Bachmann等人《核酸研究(Nuc.AcidsRes.)》18(5)：1309(1990))的非离子清洁剂稳定。然而，在一些应用中，20-稳定的DNA聚合酶具有低的扩增效率或导致非特异性产物的扩增。此外，一些清洁剂需要高浓度。而且，还已知一些清洁剂(例如，NP-40)具有毒性。因此，需要改进在溶液中热稳定DNA聚合酶的稳定性的化合物，且具体来说在不需要对目前所使用清洁剂赋予任何缺点情况下改进酶稳定性的化合物。
技术实现思路
本文提供了用于各种组合物、试剂盒和方法的新颖化合物。此类用途可包括(但不限于)用于储存缓冲液和核酸合成或扩增反应中。在一些实施例中，提供了通过对相关起始材料化学改性合成的离子型和两性离子型清洁剂化合物。在一些实施例中，此类新颖化合物在具有热稳定聚合酶的组合物中。在一些实施例中，此类组合物为稳定的热稳定酶组合物。在一个实施例中，酶为从水生栖热菌(Thermusaquaticus)(Taq聚合酶)纯化的DNA聚合酶。在一些实施例中，酶为通过重组手段产生的DNA聚合酶。在另一实施例中，酶为与抗体(多种抗体)和/或可可逆地抑制所述聚合酶的寡核苷酸结合的DNA聚合酶。本文所提供的新颖化合物可以用于多种用途并且可以包括在各种组合物中，如(举例来说)如聚合酶链式反应(PCR)的核酸扩增反应。在某些实施例中，改性的化合物具有以下结构式：其中：R1为H、(C1-C30)烷基、(C1-C30)取代的烷基、(C1-C30)杂烷基、(C1-C30)取代的杂烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、苯基、取代的苯基，其中取代的芳基或取代的苯基被至少一种(C1-C30)烷基、(C1-C30)取代的烷基、(C1-C30)杂烷基或(C1-C30)取代的杂烷基取代；R2和/或R3各自独立地为H、CH3、CH(CH3)2、CH2(C6H5)或C(CH3)3；R4和/或R5各自独立地为H、CH3、CH(CH3)2、C6H5、CH2(C6H5)、C(CH3)3、CH2CH(CH3)2、CHCH2CH(CH3)2、CH2C6H5OH、CH2C＝CHNH(C6H5)、CH2C＝CHN＝CHNH、CH2COOH、CH2CONH2、(CH2)2CONH2、(CH2)2COOH、CH2SH、(CH2)nNH、(CH2)nN、CH2OH、CH(OH)CH3、(CH2)2SCH3、(CH2)3NHC(NH2)＝NH，或者可替代地R3与R5一起形成5-或6-元环，其任选地被至少一种(C1-C30)烷基、(C1-C30)取代的烷基、(C1-C30)杂烷基、(C1-C30)取代的杂烷基取代；以及，每个n独立为任何正整数，其包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。在某些实施例中，R1为C8烷基。在某些实施例中，R1为C12烷基。在其它实施例中，R1为C16烷基。在某些实施例中，R2和/或R3各自独立地选自H和CH3。在某些实施例中，R4和/或R5各自独立地选自H、(CH2)nNH、(CH2)nN，或者可替代地R3与R5一起形成5-或6-元环。在某些实施例中，提供了具有式1的新颖化合物。在一些实施例中，新颖化合物BrijL-23-脯胺酸具有以下结构式：并且/或者提供了其衍生物。还提供了用于聚合和/或扩增核酸的方法，其包含将目标核酸与至少一种聚合酶、引物、dNTP以及至少一种具有式I的新颖化合物混合，并且聚合和/或扩增目标核酸。在此类方法的一些实施例中，利用了至少一种引物。在某些实施例中，提供了包含至少一种聚合酶、dNTP、至少一种引物以及至少一种具有式I的新颖化合物的核酸扩增反应混合物。在一些实施例中，反应混合物可另外包含可检测标记。在某些实施例中，该方法另外包括用于检测可检测标记以定量扩增的核酸的一个或多个步骤。在某些实施例中，提供了在热循环过程期间通过将具有式I的新颖清洁剂包括在其中抑制聚合酶失活的方法。在某些实施例中，提供了用于提供具有聚合酶活性的酶和至少一种具有式I的新颖清洁剂并且在使得酶的聚合酶活性稳定的条件下将其合并以形成混合物的方法。在某些实施例中，聚合酶是热稳定的。在某些实施例中，本文中所描述的方法提供具有与当在常规(例如，已知)清洁剂，如(举例来说)NP-40和/或20存在下时类似(例如，大致相同)扩增效率或提高的扩增效率的扩增反应。在一些实施例中，本文中所描述的新颖化合物可(举例来说)在储存缓冲液或扩增反应中替代NP-40和/或20(例如，如作为主混合物或预混合组合物的一部分而提供)。在某些实施例中，本文所描述的至少一种新颖化合物在组合物或反应混合物中的有效浓度等于或小于如NP-40和/或20的常规清洁剂所需要的有效浓度。在一些此类实施例中，至少一种(一种或多种)新颖化合物在反应混合物中的有效浓度可以小于如NP-40和/或20的常规(一种或多种)清洁剂所需要的有效浓度的至多、约，或至少一、二、三、四、五、六、七、八、九或十倍。在一些实施例中，至少一种新颖化合物如BrijL-23-脯胺酸的有效浓度0.0001％至10％。举例来说，在一些实施例中，BrijL-23-脯胺酸在组合物或反应混合物中的浓度为0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％或10％。在一些优选实施例中，BrijL-23-脯胺酸在所述组合物或反应混合物中的浓度为0.01％至5％，如0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％和5％。还提供了产生新颖化合物的方法。在某些实施例中，本文提供了包含具有式I的新颖化合物中的至少一种(如BrijL-23-脯胺酸)的组合物。在某些实施例中，提供了包含至少一种聚合酶和具有式I的新颖化合物中至少一种(如BrijL-23-脯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有式I的化合物：其中：R1为C12烷基。在某些实施例中，R2和R4为H。在某些实施例中，R3与R5一起形成5‑元环，并且每个n独立为任何正整数，其包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29以及30。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.25 US 61/895,8761.一种具有式I的化合物：其中：R1为C12烷基。在某些实施例中，R2和R4为H。在某些实施例中，R3与R5一起形成5-元环，并且每个n独立为任何正整数，其包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29以及30。2.一种化合物，其具有所述以下结构：3.一种包含聚合酶和根据权利要求2所述的化合物的组合物。4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述聚合酶是热稳定的。5.根据权利要求3所述的组合物，其包含以下各者中的一者或多者：a)至少一种核苷三磷酸b)DTTc)KCld)MgCl2e)Kathonf)EDTAg)明胶h)三羟甲基氨基甲烷i)甘油j)BSA6.根据权利要求3所述的组合物，其另外包含聚合酶抑制剂。7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述聚合酶抑制剂为至少一种寡核苷酸抑制剂。8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述聚合酶抑制剂为至少一种抗体抑制剂。9.根据权利要求3所述的组合物，其中所述聚合酶稳定至少约一个月至约三年。10.一种包含储存或反应组合物的试剂盒，所述组合物包含聚合酶和根据权利要求2所述的化合物。11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述聚合酶是热稳定的。12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述聚合酶为从水生栖热菌(Taq)聚合酶中分离的聚合酶。13.根据权利要求11所述的试剂盒，其另外包含聚合酶抑制剂。14.一种用于提高所述聚合酶效率的方法，所述方法包含以下步骤：a)将目标核酸与至少一种聚合酶、至少一种引物、dNTP和根据权利要求2所述的化合物混合；以及，b)扩增所述目标核酸。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述提高的效率与当在NP-40和/或的存在下所述聚合酶替代所述化合物时的所述效率相同。16.根据权利要求14所述的方法，其中所述提高的效率大于当在NP-40和/或的存在下所述聚合酶替代所述化合物时的所述效率。17.根据权利要求14所述的方法，其中所述化合物的所述有效浓度小于常规清洁剂所需要的有效浓度至少一倍至十倍。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述常规清洁剂为NP-40或19.一种用于检测在样本中目标核酸的方法，所述方法包含以下步骤：a)形成反应混合物，所述反应混合物包含至少一种聚合酶、至少一种引物、dNTP、根据权利要求2所述的化合物以及可检测标记；b)扩增所述目标核酸；以及，c)检测由所述可检测标记产生的信号，所述可检测标记指示在所述样本中所述目标核酸的存在和/或量。20.一种用于在热循环过程中抑制聚合酶失活的方法，所述方法包含在所述热循环过程期间将所述聚合酶与根据权利要求2所述的化合物接触。21.根据权利要求20所述的方法，其中聚合酶失活的所述抑制与当在NP-40和/或的存在下所述聚合酶替代所述化合物时的聚合酶失活的所述抑制相同。22.根据权利要求20所述的方法，其中聚合酶失活的所述抑制大于当在NP-40或的所述存在下所述聚合酶替代所述化合物时的聚合酶灭活的所述抑制。23.一种方法，所述方法包含在使得稳定所述酶的所述聚合酶活性的条件下，将具有聚合酶活性的酶和根据权利要求2所述的化合物混合以形成混合物。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述稳定性与当在NP-40和/或的存在下所述聚合酶替代所述化合物时的聚合酶活性的所述稳定性相同25.根据权利要求23所述的方法，其中所述稳定性更高于如当在NP-40和/或的存在下所述聚合酶替代所述化合物时聚合酶活性的所述稳定性。26.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是热稳定的。27.一种核酸扩增反应混合物，其包含：a)至少一种聚合酶；b)dNTP；以及，c)根据权利要求2所述的化合物。28.根据权利要求27所述的核酸扩增反应混合物，其另外包含至少一种引物。29.根据权利要求27或28所述的核酸扩增反应混合物，其中所述聚合酶是热稳...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·安格里什，Z·杨，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：美国;US