聚合酶链式反应检测系统技术方案

本发明专利技术涉及用于测定系统中的核酸检测的方法和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】聚合酶链式反应检测系统 介绍 本专利技术涉及用于测定系统中的核酸检测的方法和试剂盒。 专利技术背景 聚合酶链式反应（PCR)是用于靶核酸序列的快速扩增的强有力的方法。PCR已经 促进了基因表征（包括基因表达和/或调控）和分子克隆技术（包括PCR扩增的DNA的直 接测序、等位变异的确定和感染性和遗传性疾病紊乱的检测）的发展。PCR是通过重复以下 循环进行的：含有靶序列的DNA模板的热变性、相对引物与互补DNA链的退火和用DNA聚合 酶对退火的引物进行延伸。多个PCR循环导致由侧翼扩增引物界定的核苷酸序列的扩增。 向PCR操作步骤中引入热稳定性DNA聚合酶避免了重复添加酶的需要并允许退火和引物延 伸温度的升高，其增强了引物：模板结合的特异性。因此，热稳定性聚合酶（诸如TaqDNA 聚合酶）用于提高PCR的特异性和简便性。 在许多基于PCR的扩增中，采用了信号产生系统，例如来检测所扩增的产物的产 生。在基于PCR的反应中使用的一类信号产生系统是荧光共振能量转移（FRET)系统，其 中核酸探测器包括荧光供体和受体基团。FRET标记系统具有许多优于其他标记系统的优 点，包括进行均相测定的能力，在该测定中不需要分离结合的和未结合的标记核酸探测物 的步骤。许多现有技术的主要问题与双荧光标记的寡核苷酸的合成有关。欧洲专利申请 EP1726664公开了一种检测系统，其通过使用不同熔融温度（Tm)的单标记的寡核苷酸序列 来克服该问题，所述序列在自由溶液中互相杂交以形成荧光淬灭对（荧光团/淬灭剂盒）， 一旦向所述序列之一引入互补序列则产生可测量的信号，所述序列之一具有低于所述PCR 方法的退火温度（Ta)的Tm。在该系统中，所述单标记的寡核苷酸序列之一优选比其它的长 超过10碱基并且更优选长至少15个碱基。 在使用标记的核酸探测物的检测系统中，高保真扩增是关键。由于PCR方法和Taq DNA聚合酶的性质，这样的方法可能遭受期望的聚合反应之外的替代性的副反应。例如，当 该反应在室温进行时PCR可能遭受非特异性扩增。Taq聚合酶在所有温度下均保持其部分 活性并因此能够延伸没有发生互补退火的引物，导致不期望的产物的形成。然后新合成的 区域作为模板而进一步引物延伸和合成不期望的扩增产物。但是，如果在聚合开始之前将 反应加热至大约50°C或更高的温度，则增加了引物退火的严格性，并且避免或减少了不期 望的PCR产物的合成。引物二聚体也是影响PCR的常见副反应。由于引物互相杂交并延伸，发生了引物 二聚体的积累。引物二聚体的形成导致试剂耗尽并因此导致PCR效率的总体下降和/或假 阳性结果的产生。 热启动PCR是减少非特异性扩增的方法并因此限制了包括引物二聚体的非 特异性PCR产物的形成。已经开发了许多不同的方法来实现；参见例如Moretti，T. etal.EnhancementofPCRamplificationyieldandspecificityusingAmpliTaq GoldDNApolymerase.BioTechniques25,716 - 22 (1998)和HotStartPCRwith heat-activatableprimers:anovelapproachforimprovedPCRperformanceNucleic AcidsRes(2008)36(20) :el31。这样的方法减少了PCR开始之前非特异性杂交之后的引物 延伸。但是，这样的技术仅部分解决了这样的问题，因为在PCR扩增期间仍然可能发生包括 引物二聚体形成的错误引发（mis-priming)事件（尽管已经为更少的程度）。使用PCR探 针检测PCR引物内部的序列的存在有助于阻止任何这样的非特异性产物的检测但给该过 程增加了显著的费用，因为每个所要被检测的单独序列都需要专用探针。成本划算的高通 量遗传分析需要使用通用检测系统但原则上这会被非特异性扩增产物的检测所影响。 需要易于合成、费用低并且可靠的特异性检测系统用于引物延伸产物的检测中 (例如在均相PCR测定中），其解决了现有用于PCR的检测系统所遇到的问题。术语均相 PCR测定是本领域公知的，并且是不必物理上互相分离反应成分以得到反应结果的测定。本 专利技术是基于以下发现：互相杂交形成荧光淬灭对的标记的寡核苷酸序列的相对长度的选择 导致核酸检测测定系统的改良，特别是当被用于实时背景（setting)下时。在本专利技术中，荧 光团/淬灭剂盒的Tm被设计为大于扩增的Ta，使得任何没有掺入的荧光寡核苷酸与淬灭 剂寡核苷酸在荧光获取温度进行杂交，使反应被实时监测或在终点进行监测。通过调整淬 灭剂寡核苷酸的长度和Tm，可以预期的是提高的荧光团/淬灭剂盒的稳定性将简单地抑制 PCR。但是，意外地发现来自荧光引物的扩增的特异性得到提高，如在实时情况下样品和无 模板对照之间的Cq值（也称为Ct值）的差异的显著增加所显示，或者在终点应用中无模 板对照的降低的检测所显示。 专利技术概述 本专利技术提供一种用于检测引物延伸产物的方法，所述方法包括以下步骤： a)提供一个或多个寡核苷酸引物组，每组包含一个或多个寡核苷酸引物集，每个 引物集的特征在于i)第一寡核苷酸引物（正向引物），其具有靶特异性部分（portion)和5'上游荧 光盒特异性部分，以及ii)第二寡核苷酸引物（反向引物），其具有靶特异性部分， 其中特定引物集中的寡核苷酸引物分别适合于在相应靶核苷酸序列的互补链上 的杂交以允许引物延伸产物的形成，例如PCR产物， 并且其中同一组中的每个引物集的第一寡核苷酸引物含有荧光盒特异性部分，所 述荧光盒特异性部分能够与同一组中任一引物集的第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部 分的互补物进行杂交；b)提供一个或多个盒（cassette)寡核苷酸集，每个集的特征在于i)第一盒寡核苷酸，其用荧光部分（moiety)(供体部分）标记，并且具有能够与给 定寡核苷酸引物组中任一引物集的第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的互补物进行 杂交的序列，以及ii)第二盒寡核苷酸，其用受体部分（例如淬灭剂部分）标记， 其中每个盒寡核苷酸集互相杂交形成荧光淬灭对，其中所述荧光淬灭对具有Tm A； c)起始引物延伸反应，从而产生与相关的第一寡核苷酸引物互补的序列（如果存 在相关的靶多核苷酸）， 这样，相关的第二（受体，例如淬灭剂，被标记）盒寡核苷酸与相关的第一（荧光 标记）盒寡核苷酸杂交的能力较低，藉以产生信号；以及 d)检测所产生的信号， 其中所述引物延伸反应至少部分在小于一个或多个荧光淬灭对的TmA的Ta进 行。 本专利技术还提供了用于这样的方法的合适的试剂盒。 附图简述 图1是用于在实施本专利技术方法的SNP基因分型中检测DNA序列的简单反应流程 图。 图2显示使用如下面实施例2中所述的测定所产生的数据。用于荧光团/淬灭剂 盒5(左图）和荧光团/淬灭剂盒1(右图）的扩增产物的实施例基因分型数据。在每个实 施例中存在的三个簇代表了能被检测的三种可能的基因型。无模板对照由黑实线表示并且 为了清晰而圈上。 图3显示使用如下面实施例3中所述的测定所产生的数据。用于荧光团/淬灭剂 盒5(左图）和荧光团/淬灭剂盒1(右图）的扩增产物的实施例基因分型数据。在每个本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测引物延伸产物的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供一个或多个寡核苷酸引物组，每组包含一个或多个寡核苷酸引物集，每个引物集的特征在于i)第一寡核苷酸引物(正向引物)，其具有靶特异性部分和5'上游荧光盒特异性部分，以及ii)第二寡核苷酸引物(反向引物)，其具有靶特异性部分，其中特定引物集中的寡核苷酸引物分别适用于在相应靶核苷酸序列的互补链上的杂交以允许形成引物延伸产物，例如PCR产物，并且其中同一组中的每个引物集的第一寡核苷酸引物含有荧光盒特异性部分，所述荧光盒特异性部分能够与同一组中任一引物集的第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的互补物进行杂交；b)提供一个或多个盒寡核苷酸集，每集的特征在于i)第一盒寡核苷酸，其用荧光部分(供体部分)标记，并且具有能够与给定寡核苷酸引物组中任一引物集的第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的互补物进行杂交的序列，以及ii)第二盒寡核苷酸，其用受体部分(例如淬灭剂部分)标记，其中每个盒寡核苷酸集互相杂交以形成荧光淬灭对，其中所述荧光淬灭对具有Tm A；c)起始引物延伸反应，从而产生与相关的第一寡核苷酸引物互补的序列(如果存在相关的靶多核苷酸)，这样，相关的第二(受体，例如淬灭剂，被标记)盒寡核苷酸与相关的第一(荧光标记)盒寡核苷酸杂交的能力降低，藉以产生信号；以及d)检测所产生的信号，其中所述引物延伸反应至少部分在小于一个或多个荧光淬灭对的Tm A的Ta进行。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：尼沙·吉恩，约翰·E·霍尔梅，
申请(专利权)人：LGC基因组学有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB