用于聚合酶链式反应(PCR)的新型组合物、方法和试剂盒技术

本公开内容涉及用于使用双重热启动反应混合物扩增靶核酸同时减少非特异性扩增和非期望的扩增产物的组合物、方法和试剂盒，所述双重热启动反应混合物包含至少两个不同的热启动机制。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于聚合酶链式反应(PCR)的新型组合物、方法和试剂盒领域本公开内容总地来说涉及用于扩增核酸同时减少非特异性扩增和/或非期望的扩增产物的组合物、方法和试剂盒。背景虽然聚合酶链式反应(PCR)和相关技术对于各种应用是高度有用的，但因非期望的副反应而产生的非靶核酸的扩增可呈现严重问题。这样的副反应可因非靶核酸的错误引发(mis-priming)和/或引物寡聚化(有时称为引物-二聚体形成)和这些引物引发假象的后续扩增而发生。这在其中使用具有显著背景核酸而靶核酸以低拷贝数存在的核酸混合物来进行PCR的应用中尤其如此(参见，例如，Chou等人,Nucl.AcidsRes.20:1717(1992))。非特异性扩增产物的产生至少部分归因于DNA聚合酶在环境温度延伸非特异性退火的引物的活性(参见，例如，Chou等人,同上；Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:4580(1990))。因此，抑制DNA聚合酶在室温的活性在控制次级扩增子的产生中是有益的。已描述了几个据报导减少非期望的第二扩增产物形成的“热启动”技术。根据某些“手工热启动”技术，在混合物的温度未高至足以阻止非特异性引物退火之前，不向反应混合物中添加对于DNA聚合酶活性至关重要的组分(例如，二价离子和/或DNA聚合酶本身)(参见，例如，Chou等人,同上；D’Aquila等人,Nucl.AcidsRes.19:3749(1991))。较不劳动密集型的技术使用扩增反应的至少一种组分的物理隔离或可逆失活。例如，可将镁或DNA聚合酶隔离在石蜡珠粒中，随着反应温度升高所述石蜡珠粒熔化，从而仅在升高的温度释放隔离的组分。根据其它技术，例如通过DNA聚合酶的可逆化学修饰、抗体对DNA聚合酶的结合或结合DNA聚合酶的寡核苷酸分子来可逆地使DNA聚合酶失活或修饰其(参见，例如，美国专利No.5,677,152和5,338,671；和Dang等人,J.Mol.Biol.264:268(1996))。在升高的反应温度下，化学修饰被逆转，或抗体分子或寡核苷酸分子被变性，从而释放功能性DNA聚合酶。然而，这些技术中的一些技术似乎不是最佳的，因为可在较低反应温度检测到一定的DNA聚合酶活性(尽管进行了失活)，或它们需要反应混合物在高温的持久暴露，以完全活化DNA聚合酶，这可导致反应混合物的一些组分永久性失活。某些目前使用的核酸扩增技术包括用于检测和/或定量扩增产物(其包含核酸染料，例如但不限于绿I(LifeTechnologies,Carlsbad,CA))的步骤，包括某些实时和/或终点检测技术(参见，例如，Ririe等人,Anal.Biochem.245:154(1997))。通常情况下，核酸染料与扩增产物和/或引物-模板双链体的双链区段结合，并以作为特定核酸染料的特征的波长发射可检测荧光信号。某些扩增法包括用于评价与核酸染料结合的扩增产物的纯度的检测步骤，例如但不限于PCR后解离曲线分析，也称为解链曲线分析。由于扩增子的解链曲线依赖于其长度和序列(除其它以外)，因此扩增子可一般地通过它们的解链曲线来区分(参见，例如，Zhang等人,Hepatology36:723(2002))。可通过当反应温度经过扩增子的解链温度时监测核酸染料的荧光，来在某些扩增反应过程中获得解离或解链曲线。双链扩增子的解离被观察为在核酸染料特征性的发射波长上荧光的突然下降。根据某些解离曲线分析技术，当解链曲线显示单个恒定的解链温度(有时在图形上在荧光强度的负导数对温度(-dF/dt对T)的曲线上显示为峰)时，扩增产物被归类为“纯的”。相反地，来自单重扩增的这样的解离曲线中多个峰的出现通常表明非期望的副反应产物的存在。当使用这样的基于核酸染料的扩增产物检测技术时，通常期望：1)至少减少并优选消除非期望的副反应产物的形成，和2)至少减少和优选消除因其它核酸，即非扩增产物(例如，引物二聚体)和/或非特异性扩增产物(例如，因错误引发事件而产生的)的双链区段的变性而导致的荧光峰。某些其他扩增技术还可因除其它以外，引物、连接探针、切割探针、启动子-引物等的非特异性退火和随后酶在最适温度以下的活性而产生非期望的扩增产物。例如，当通常在室温组合反应组分时，或当将反应组合物加热到所需的反应温度时。这些技术的至少一些可受益于本底荧光的减弱。因此，存在对这样的组合物和方法的需要，所述组合物和方法减少和/或消除1)非期望的副反应产物的形成和2)由这些非期望的副反应产物导致的本底荧光。概述本教导涉及用于扩增靶核酸同时减少非特异性扩增(例如，荧光)和非期望的扩增产物(有时在本领域中称为第二扩增子或假性副产物)的组合物、方法和试剂盒。在某些实施方案中，提供了包含核酸聚合酶和双重热启动反应混合物的组合物，所述双重热启动反应混合物在第一温度(例如，<40℃的温度)抑制或实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性。双重热启动反应混合物包含至少2个不同的热启动机制，所述热启动机制用于在第一温度抑制或实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性。这样的热启动机制包括但不限于在较低温度阻断DNA聚合酶活性的抗体或抗体的组合、在较低温度阻断DNA聚合酶活性的寡核苷酸、在升高的温度解离的DNA聚合酶的可逆化学修饰、在较低温度提供降低的活性的DNA聚合酶的氨基酸修饰、包括超稳定DNA结合结构域和拓扑异构酶的融合蛋白、抑制DNA聚合酶的温度依赖性配体、在较低温度隔离引物的单链结合蛋白、修饰的引物或修饰的dNTP。在某些实施方案中，双重热启动反应混合物相较于常规热启动机制，在延长的时期内抑制非特异性核酸扩增和/或非特异性产物形成。例如，在一些实施方案中，本专利技术的双重热启动反应混合物在环境温度抑制非特异性核酸扩增和/或非特异性产物形成，持续至少24小时。在某些实施方案中，双重热启动反应混合物相较于仅具有单个热启动机制的热启动反应混合物，使非特异性扩增和/或非特异性产物形成减少约20-100％。在某些实施方案中，双重热启动反应混合物使非特异性扩增和/或非特异性产物形成减少约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％。在某些实施方案中，双重热启动反应混合物相较于仅具有单个热启动机制的反应混合物，使非特异性产物形成减少至约1/2至1/4。在某些实施方案中，双重热启动反应混合物使非特异性产物形成减少至约1/2、2/5、1/3、2/7或1/4。在某些实施方案中，提供了包含热稳定性核酸聚合酶和双重热启动反应混合物的组合物，所述双重热启动反应混合物在低于约40℃的温度抑制或实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性，以便双重热启动反应混合物在高于约40℃的温度不实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性。在某些实施方案中，核酸聚合酶可以是DNA依赖性DNA聚合酶或RNA依赖性DNA聚合酶。在某些实施方案中，核酸聚合酶可以是热稳定性的。在某些实施方案中，提供了抑制核酸聚合酶的聚合酶活性的方法。在某些实施方案中，这些方法包括将聚合酶与双重热启动反应混合物接触，其中双重热启动反应混合物在第一温度(例如，<40本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，其包含：a)核酸聚合酶；和b)双重热启动反应混合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.06.14 US 61/659,5871.一种组合物，其包含：
a)核酸聚合酶；
b)第一热启动机制，其包含特异于所述聚合酶的抗体或抗体的组合；和
c)第二热启动机制；
其中所述第一热启动机制和所述第二热启动机制不同，并且二者一起能够在第一温度实质性抑制所述核酸聚合酶的活性而在第二温度不实质性抑制所述核酸聚合酶的活性，
其中所述第二热启动机制选自在较低温度阻断聚合酶活性的寡核苷酸、在升高的温度解离的核酸聚合酶的可逆化学修饰、在较低温度提供降低的活性的核酸聚合酶的氨基酸修饰、包括超稳定核酸结合结构域和拓扑异构酶的融合蛋白和抑制聚合酶活性的温度依赖性配体。


2.权利要求1的组合物，其中所述核酸聚合酶为DNA依赖性DNA聚合酶或RNA依赖性DNA聚合酶。


3.权利要求1的组合物，其中所述核酸聚合酶为热稳定性的。


4.权利要求1的组合物，其中所述核酸聚合酶选自TaqDNA聚合酶、TflDNA聚合酶、TfiDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、VentTMDNA聚合酶。


5.一种组合物，其包含：
a)热稳定性核酸聚合酶；
b)第一热启动机制，其包含特异于所述聚合酶的抗体或抗体的组合；和
c)第二热启动机制；
其中所述第一热启动机制和所述第二热启动机制不同，并且二者一起能够在低于40℃的温度实质性抑制所述核酸聚合酶的活性而在高于40℃的温度不实质性抑制所述核酸聚合酶的活性，
其中所述第二热启动机制选自在较低温度阻断聚合酶活性的寡核苷酸、在升高的温度解离的核酸聚合酶的可逆化学修饰、在较低温度提供降低的活性的核酸聚合酶的氨基酸修饰、包括超稳定核酸结合结构域和拓扑异构酶的融合蛋白和抑制聚合酶活性的温度依赖性配体。


6.权利要求5的组合物，其中所述热稳定性核酸聚合酶为DNA依赖性DNA聚合酶或RNA依赖性DNA聚合酶。


7.权利要求5的组合物，其中所述热稳定性核酸聚合酶选自TaqDNA聚合酶、TflDNA聚合酶、TfiDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、Ven...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·博纳斯，M·刘，J·史蒂文斯，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：美国;US