脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针及试剂盒。所述试剂盒包括脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针，所述引物包括9对引物，所述探针包括15条探针；本发明专利技术的脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针及试剂盒利用荧光定量PCR技术，增加现有专利技术中所没有的常见突变位点的检测，实现一次性特异的检测16种由于SMN基因缺失、转换与点突变导致的SMA患者并实现对SMA患者的分型。

【技术实现步骤摘要】
脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针及试剂盒
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针及试剂盒。
技术介绍
脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy，SMA)是一种较常见的遗传性疾病，儿童起病的SMA呈常染色体隐性遗传。携带者发生率为1/35-1/80，最近报道中国人群SMA致病基因的携带者频率为1/42，群体发病率为1/5000-1/10000活产婴儿，居儿童致死性常染色体遗传病的第二位，仅次于囊性纤维变性。脊髓性肌萎缩症国际协会根据SMA患者的发病年龄和临床表现分为4型：I型(严重型)、Ⅱ型(中间型)、Ⅲ型(轻型)和IV型(成人型)。目前，临床上常用于辅助脊髓性肌萎缩症检测的方法主要有肌电图、肌肉活检组织化学染色及血清肌酸磷酸激酶(CPK)检测。但SMA的临床变异性大，肌电图在儿童患者不易配合检查，肌肉活检为有创性检查，令家长难以接受，且需冰冻切片组化染色的条件，更难以在临床上广泛开展，即使可以推行，肌电图和肌肉活检亦均缺乏特异性，因此本病极易误诊。为了能够更准确地对患者进行确诊，以防止重症患者的出生，就需要对患者的基因型进行检测。发展至今，在国内外用于SMA基因诊断的主要方法有：①连锁分析；②聚合酶链反应单链构象多态性(PCR-SSCP)技术；③错配聚合酶链反应一限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析；④变性高效液相分析技术(DHPLC)；⑤多重连接探针依赖性扩增技术(MLPA)⑥实时荧光定量PCR(Real-timePCR)技术；⑦高分辨率溶解曲线(HightResolutionMeltingAnalysis，HRMA)；⑧数字PCR技术(DigitalPCR)。现有产品及专利见表1。表1专利《脊髓性肌萎缩症相关基因突变检方法、相关检测探针组合物及检测试剂盒、以及相关应用》只对SMN1的外显子7、外显子8进行检测，没有对SMN2的外显子7进行检测，也就意味着只能鉴别是否为SMA的患者，而没有对SMA患者的轻重程度进行鉴定，对患者的生活质量没有指导意义，并且对外显子7、外显子8分管检测，间接增加了工作量及检测的成本；专利《一种诊断人类脊髓性肌萎缩症的荧光定量PCR试剂盒》对SMN1及SMN2进行了检测，还外加了NAIP基因进行检测，虽增加了SMA疾病检测的基因分型，但该方法采用Taqman对SMN1、SMN2仅几个位点单碱基的差异容易造成非特异性，在临床检测中具有极高的风险；综上所述的方法均只能实现对缺失型SMA患者的检测；仍有非缺失型SMA患者不在该方案的检测范围。现有技术中对脊髓性肌萎缩症致病基因的检测位点少，且不能实现患者SMAI型(严重型)、Ⅱ型(中间型)、Ⅲ型(轻型)的分型，大部分荧光定量采用单内参标准化，定量检测结果判断存在一定的主观因素，导致结果不能准确反应样本真实情况，增加临床检测特别是产前诊断的风险；而采用MLPA技术操作时间比较长，且需要多步开盖操作，增加了污染的风险，检测成本偏高，也不能实现对突变点的检测，因此不能满足SMA临床诊断快速、检测范围广的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种实现一次性特异的检测16种由于SMN基因缺失、转换与点突变导致的SMA患者并实现对SMA患者的分型的脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针及试剂盒。本专利技术的技术方案为：提供一种脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针，所述引物包括9对引物，所述探针包括15条探针；所述9对引物(包括内参扩增引物)为：引物SMN-EX1-F，其序列为：ACATAACCTCTAACCAGGTAAGTTTCCT；引物SMN-EX1-R，其序列为：TCAGTGCTGTATCATCCCAAATG；引物SMN-EX2a-F，其序列为：AGTTGTTTTTATTTCTTACCCTTTCCA；引物SMN-EX2a-R，其序列为：CATTTCATACCTTAAATGAAGCCAC；引物SMN-EX3-F，其序列为：CCCTCTTCAAAAGAAATGTGTGC；引物SMN-EX3-R，其序列为：GTATCCTTACCTCTTGAGCATTTTGTT；引物SMN-EX4-F，其序列为：GAGAATGAAAATGAAAGCCAAGTTTC；引物SMN-EX4-R，其序列为：GCTTGATGTTATCTGATTTATTTCCAG；引物SMN-EX5-F，其序列为：CTAAAATTCAATGGCCCACCA；引物SMN-EX5-R，其序列为：CGATTAATAGTTTAACATACACTTTCGT；引物SMN-EX6-F，其序列为：ACCTCCCATATGTCCAGATTCTCT；引物SMN-EX6-R，其序列为：GAAAAGATGCTGAGTGATTACTTACCA；引物SMN-EX7-F，其序列为：GTAAAATGTCTTGTGAAACAAAATGCT；引物SMN-EX7-R，其序列为：GTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTG；引物SMN-EX8-F，其序列为：AAAAGGAAGTGGAATGGGTAACTCT；引物SMN-EX8-R，其序列为：AAAAGGAAGTGGAATGGGTAACTCT；内参引物ACTB-F，其序列为：GCTCCATCCTGGCCTCGC；内参引物ACTB-R，其序列为：AGAAGCATTTGCGGTGGACG；所述15条探针为：探针SMN-EX1-P1，其序列为：TTGCCGCCGCTGCTCATCG；探针SMN-EX1-P2，其序列为：CTTTCCAGGAGCGATGA；探针SMN-EX2a-P，其序列为：AATGTCAGAAATCATCGC；探针SMN-EX3-P1，其序列为：CTTCTGACTAAATGGC；探针SMN-EX3-P2，其序列为：AAATAGGAGCAAAATC；探针SMN-EX3-P3，其序列为：CAATCTGTAGCTAATAAT；探针SMN-EX4-P，其序列为：GATGAAAGAGAAACTC；探针SMN-EX5-P，其序列为：CACCCCACATACTATC；探针SMN-EX6-P1，其序列为：TTGATGATGGGAATTAT；探针SMN-EX6-P2，其序列为：CAATATGACAGCCAC；探针SMN1-7P，其序列为：ATTTTGTCTGAAACCCTG；探针SMN2-7P，其序列为：TGATTTTGTCTAAAACCCTG；探针SMN-EX7-P，其序列为：CTTAATTTAAGGAATGTGAGCAC；探针SMN-EX8-P，其序列为：CACCCCAGTCTTTTACAGAT；内参探针ACTB-P，其序列为：CCACCTTCCAGCAGAT。优选的，上述的脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针中，所述15条探针的5’端和3’端分别设有荧光基团和荧光淬灭基团，具体如下：探针SMN-EX1-P1为：NED-TTGCCGCCGCTGCTCATCG-MGB；探针SMN-EX1-P2为：NED-CTTTCCAGGAGCGATGA-MGB；探针SMN-EX2a-P为：NED-AATGTCAGAAATCATCGC-MGB；探针SMN-EX3-P1为：NED-CTTCTG本文档来自技高网...

【技术保护点】
脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针，其特征在于，所述引物包括9对引物，所述探针包括15条探针；所述9对引物为：引物SMN‑EX1‑F，其序列为：ACATAACCTCTAACCAGGTAAGTTTCCT；引物SMN‑EX1‑R，其序列为：TCAGTGCTGTATCATCCCAAATG；引物SMN‑EX2a‑F，其序列为：AGTTGTTTTTATTTCTTACCCTTTCCA；引物SMN‑EX2a‑R，其序列为：CATTTCATACCTTAAATGAAGCCAC；引物SMN‑EX3‑F，其序列为：CCCTCTTCAAAAGAAATGTGTGC；引物SMN‑EX3‑R，其序列为：GTATCCTTACCTCTTGAGCATTTTGTT；引物SMN‑EX4‑F，其序列为：GAGAATGAAAATGAAAGCCAAGTTTC；引物SMN‑EX4‑R，其序列为：GCTTGATGTTATCTGATTTATTTCCAG；引物SMN‑EX5‑F，其序列为：CTAAAATTCAATGGCCCACCA；引物SMN‑EX5‑R，其序列为：CGATTAATAGTTTAACATACACTTTCGT；引物SMN‑EX6‑F，其序列为：ACCTCCCATATGTCCAGATTCTCT；引物SMN‑EX6‑R，其序列为：GAAAAGATGCTGAGTGATTACTTACCA；引物SMN‑EX7‑F，其序列为：GTAAAATGTCTTGTGAAACAAAATGCT；引物SMN‑EX7‑R，其序列为：GTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTG；引物SMN‑EX8‑F，其序列为：AAAAGGAAGTGGAATGGGTAACTCT；引物SMN‑EX8‑R，其序列为：AAAAGGAAGTGGAATGGGTAACTCT；内参引物ACTB‑F，其序列为：GCTCCATCCTGGCCTCGC；内参引物ACTB‑R，其序列为：AGAAGCATTTGCGGTGGACG；所述15条探针为：探针SMN‑EX1‑P1，其序列为：TTGCCGCCGCTGCTCATCG；探针SMN‑EX1‑P2，其序列为：CTTTCCAGGAGCGATGA；探针SMN‑EX2a‑P，其序列为：AATGTCAGAAATCATCGC；探针SMN‑EX3‑P1，其序列为：CTTCTGACTAAATGGC；探针SMN‑EX3‑P2，其序列为：AAATAGGAGCAAAATC；探针SMN‑EX3‑P3，其序列为：CAATCTGTAGCTAATAAT；探针SMN‑EX4‑P，其序列为：GATGAAAGAGAAACTC；探针SMN‑EX5‑P，其序列为：CACCCCACATACTATC；探针SMN‑EX6‑P1，其序列为：TTGATGATGGGAATTAT；探针SMN‑EX6‑P2，其序列为：CAATATGACAGCCAC；探针SMN1‑7P，其序列为：ATTTTGTCTGAAACCCTG；探针SMN2‑7P，其序列为：TGATTTTGTCTAAAACCCTG；探针SMN‑EX7‑P，其序列为：CTTAATTTAAGGAATGTGAGCAC；探针SMN‑EX8‑P，其序列为：CACCCCAGTCTTTTACAGAT；内参探针ACTB‑P，其序列为：CCACCTTCCAGCAGAT。...

【技术特征摘要】
1.脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针，其特征在于，所述引物包括9对引物，所述探针包括15条探针；所述9对引物为：引物SMN-EX1-F，其序列为：ACATAACCTCTAACCAGGTAAGTTTCCT；引物SMN-EX1-R，其序列为：TCAGTGCTGTATCATCCCAAATG；引物SMN-EX2a-F，其序列为：AGTTGTTTTTATTTCTTACCCTTTCCA；引物SMN-EX2a-R，其序列为：CATTTCATACCTTAAATGAAGCCAC；引物SMN-EX3-F，其序列为：CCCTCTTCAAAAGAAATGTGTGC；引物SMN-EX3-R，其序列为：GTATCCTTACCTCTTGAGCATTTTGTT；引物SMN-EX4-F，其序列为：GAGAATGAAAATGAAAGCCAAGTTTC；引物SMN-EX4-R，其序列为：GCTTGATGTTATCTGATTTATTTCCAG；引物SMN-EX5-F，其序列为：CTAAAATTCAATGGCCCACCA；引物SMN-EX5-R，其序列为：CGATTAATAGTTTAACATACACTTTCGT；引物SMN-EX6-F，其序列为：ACCTCCCATATGTCCAGATTCTCT；引物SMN-EX6-R，其序列为：GAAAAGATGCTGAGTGATTACTTACCA；引物SMN-EX7-F，其序列为：GTAAAATGTCTTGTGAAACAAAATGCT；引物SMN-EX7-R，其序列为：GTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTG；引物SMN-EX8-F，其序列为：AAAAGGAAGTGGAATGGGTAACTCT；引物SMN-EX8-R，其序列为：AAAAGGAAGTGGAATGGGTAACTCT；内参引物ACTB-F，其序列为：GCTCCATCCTGGCCTCGC；内参引物ACTB-R，其序列为：AGAAGCATTTGCGGTGGACG；所述15条探针为：探针SMN-EX1-P1，其序列为：TTGCCGCCGCTGCTCATCG；探针SMN-EX1-P2，其序列为：CTTTCCAGGAGCGATGA；探针SMN-EX2a-P，其序列为：AATGTCAGAAATCATCGC；探针SMN-EX3-P1，其序列为：CTTCTGACTAAATGGC；探针SMN-EX3-P2，其序列为：AAATAGGAGCAAAATC；探针SMN-EX3-P3，其序列为：CAATCTGTAGCTAATAAT；探针SMN-EX4-P，其序列为：GATGAAAGAGAAACTC；探针SMN-...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晶晶，李长远，向筑，
申请(专利权)人：亚能生物技术深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44