本发明专利技术涉及一种用于检测犬细小病毒的引物、探针和试剂盒及检测方法。一种检测犬细小病毒的荧光定量PCR的引物，包括：上游检测引物CPV‑F包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；下游检测引物CPV‑R包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。探针包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。试剂盒包括上述的引物和探针。本发明专利技术所述检测犬细小病毒的荧光定量PCR的引物、探针和试剂盒具有操作简便、成本低、灵敏度高和特异性好等优点，为临床检测提供保障。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒的检测领域，尤其涉及一种一步法直接检测犬细小病毒的荧光定量PCR的引物、探针、试剂盒及其检测方法。
技术介绍
犬细小病毒(CanineParvovirus，CPV)是引起犬科动物以剧烈的呕吐、出血性肠炎、非化脓性心肌炎和白细胞显著减少为主要特征的烈性传染病毒。犬细小病毒病是一种具有高度接触性的烈性传染病，以呕吐、腹泻和白细胞减少为特征。自然感染犬细小病毒的病例经常发生，即使CPV疫苗免疫后也会发病，幼犬的死亡率非常高(20％-30％)。随着犬饲养业的快速发展，尤其是实验用犬和宠物犬饲养量的大幅增加，犬感染细小病毒病日趋严重，给犬饲养业造成了重大的经济损失。犬细小病毒是一条单负链DNA病毒，无包膜，对物理化学因素具有很强的抵抗力，病毒在粪便中可以存活很长时间，致病力不会降低，传染性很强。病犬是主要的传染源，动物主要通过接触感染发病。犬细小病毒分为1型和2型，其中2型又分为2a、2b和2c三个亚型，CPV-2a、2b与CPV-2相比，只有几个氨基酸的差异。犬细小病毒2型(CPV-2)是引起犬细小病毒病的主要病原微生物。病毒颗粒直径约20-25nm，基因组长5323bp，有两个主要的开放读码框(ORF)：NS读码框和S读码框，前者产物NS1和NS2两种非结钩蛋白，为基因复制和转录所必需，后者主要编码衣壳蛋白VP1(70-90kD)、VP2(62-76kD)及VP3(39-69kD)。VP2是构成病毒衣壳的主要成>分，决定了病毒的宿主范围和抗原性。目前检测犬细小病毒的方法主要是观察临床症状，病毒检测方法有试纸条，也有报道用传统PCR和荧光定量PCR，但试纸条的准确性普遍较差，而传统PCR方法耗时较长且灵敏度偏低。但是目前存在的荧光定量PCR虽然相比传统PCR方法和试纸条检测的方法灵敏度和准确度提高，但是仍然存在着检测成本偏高、耗时较长、操作复杂等缺陷。例如，在荧光定量PCR时，需要利用核酸提取液对样本进行预处理并提取病毒核酸(例如：DNA和RNA等)，如果核酸提取的质量不好，会对后续的实验进行影响，尤其是RNA容易发生降解，所以提取的步骤都较为复杂且严格。也有利用生物条形码进行检测犬细小病毒的方法，但是该方法需要用于检测犬细小病毒的生物条形码、与条形码配合使用的互补探针NP链及其核苷酸序列配合使用，并且该方法操作更加复杂，而且成本较高，不利于大样本量检测和流行病学调查研究。
技术实现思路
鉴于目前犬细小病毒检测方法的局限性，本专利技术建立了检测犬细小病毒的一步法直接定量PCR检测方法，具有操作简便、成本低、灵敏度高和特异性好等优点，为临床检测提供保障。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：用于犬细小病毒检测的引物，包括：上游检测引物CPV-F包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.1所示的核苷酸序列为5′-GAAGGTATAAATTCACCAGGTTGC-3′；下游检测引物CPV-R包括SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.2所示的核苷酸序列为：5′-GTGCAAGGTCCACTACGTCC-3′。优选地，所述上游检测引物CPV-F为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，下游检测引物CPV-R为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。利用上述引物可以扩展目的片段的长度为112bp。本专利技术的有益效果是：利用上述引物进行检测时，具有很好的特异性。只需对样本进行简单预处理，不需抽提核酸，直接用样本进行检测，具有步骤更简便、成本更低、操作误差更小、耗时更短、灵敏度更高等优点，能够实现快速简便地完成检测。本专利技术还提供一种用于犬细小病毒检测的探针，包括SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.3所示的核苷酸序列为5′-AGACACAAGCGGCAAGCAATCCTC-3′。优选地，所述探针为SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。专利技术人通过反复检测、筛选和验证，意外的获得了该条探针，具有特异性较高等优点。进一步，所述探针的5′端具有荧光报告基团，所述荧光报告基团选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3和Cy5中的任一种。采用上述进一步方案的有益效果是：具有合适的、高效的(强烈的)激发和发射波长范围，并且具有光稳定性好等优点。进一步，所述探针的3′端具有淬灭基团，所述淬灭基团选自BHQ-1、BHQ-2、TAMRA。采用上述进一步方案的有益效果是：用于接收荧光报告基团发射的荧光信号，采用上述种类的淬灭基团具有灵敏度高等优点。进一步，所述探针的5′端为FAM，3′端为BHQ-1。探针(名称命名为CPV-probe)带有荧光报告基团和淬灭基团的序列为：5’FAM-AGACACAAGCGGCAAGCAATCCTC-3’BHQ-1。采用上述进一步方案的有益效果是：BHQ-1本身不产生荧光，荧光背景低，灵敏度进一步提高。本专利技术还提供一种用于犬细小病毒检测的试剂盒，该试剂盒包括上述的引物和/或上述的探针。采取上述技术方案的有益效果为：上述探针与上述引物配合使用，在检测时，只需对样本进行简单预处理，不需抽提核酸，直接用样本进行检测，具有步骤更简便、成本更低、操作误差更小、耗时更短、灵敏度更高等优点，能够实现快速简便地完成检测。进一步，该试剂盒还包括反应液A混合物、阳性对照和阴性对照中的一种或几种；所述反应液A混合物包括Taq酶和PCR反应缓冲液；所述阳性对照为包括CPV-NS基因的DNA片段、质粒或菌株；所述阴性对照为灭菌水。所述CPV-NS基因的GenBank序列号为M19296。包括CPV-NS基因的DNA片段、质粒或菌株可以采用本领域的常规方法制备。例如：可以根据CPV-NS基因的序列设计引物进行PCR扩增，获得DNA片段；可以将获得的DNA与适当的载体连接，获得含有该基因的质粒；也可以将该质粒转入菌株中，获得含有该基因的菌株。本专利技术提供一种犬细小病毒检测的方法，包括以下步骤：1)采集样品并进行预处理；2)荧光定量PCR进行扩增：将上述的引物、探针、Taq酶、PCR反应缓冲液和步骤1)的样品混合，配制PCR反应体系，得到实验组；同时设置阳性对照组和阴性对照组，阳性对照组中的样品为阳性对照，阴性对照组中的样品为阴性对照；之后将实验组、阳性对照组和阴性对照组进行荧光定量PCR进行扩增；3)结果分析和判定：a)在同一次试验中满足阴性对照组的Ct值为空白且阳性对照组的Ct值小于30，说明本次实验有效，本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于犬细小病毒检测的引物，其特征在于，包括：上游检测引物CPV‑F包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为5′‑GAAGGTATAAATTCACCAGGTTGC‑3′；下游检测引物CPV‑R包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为：5′‑GTGCAAGGTCCACTACGTCC‑3′。
【技术特征摘要】
1.用于犬细小病毒检测的引物，其特征在于，包括：
上游检测引物CPV-F包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.1所示的核
苷酸序列为5′-GAAGGTATAAATTCACCAGGTTGC-3′；
下游检测引物CPV-R包括SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.2所示的核
苷酸序列为：5′-GTGCAAGGTCCACTACGTCC-3′。
2.与权利要求1所述引物匹配使用的用于犬细小病毒检测的探针，其特征在于，包括
SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.3所示的核苷酸序列为5′-
AGACACAAGCGGCAAGCAATCCTC-3′。
3.根据权利要求2所述用于犬细小病毒检测的探针，其特征在于，所述探针的5′端具有
荧光报告基团，所述荧光报告基团选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3和Cy5中的任一种。
4.根据权利要求2或3所述用于犬细小病毒检测的探针，其特征在于，所述探针的3′端
具有淬灭基团，所述淬灭基团选自BHQ-1、BHQ-2、TAMRA。
5.用于犬细小病毒检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1所述的引物
和/或权利要求2-4任一项所述的探针。
6.根据权利要求5所述用于犬细小病毒检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括反
应液A混合物、阳性对照和阴性对照中的一种或几种；
所述反应液A混合物包括Taq酶和PCR反应缓冲液；
所述阳性对照为包括CPV-...
【专利技术属性】
技术研发人员：王文博，邱薇，曹雪峰，弓超，陈锚锚，郭平，杨显君，范泉水，
申请(专利权)人：中国人民解放军成都军区疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：云南;53
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