一种检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了TaqMan‑MGB探针法检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的引物及其应用，属于生物检测技术领域，包括SEQ ID NO：1～8所示的引物和探针。与测序法相比，本发明专利技术不需要对PCR产物进行一系列复杂的后续处理，PCR扩增和检测同步进行，整个检测过程无需开盖操作，降低了PCR产物造成污染的风险，操作简单快速，大大缩短了检测时间，且降低了检测成本。本发明专利技术可用于临床检测ADH1B基因多态性和ALDH2基因多态性，检测结果可用于指导硝酸甘油临床合理用药与健康饮酒。

【技术实现步骤摘要】
一种检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的引物及其应用
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种TaqMan-MGB探针法同时检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的方法和应用。
技术介绍
酒精代谢相关基因是分子进化和群体遗传学研究的热点之一。酒精化学名乙醇，饮酒后乙醇经肠胃吸收进入血液。进入体内的乙醇90％--95％通过肝脏进行代谢，其余随尿液、汗液和呼吸排出。乙醇在肝脏内主要需经过两步代谢反应：从乙醇氧化为乙醛；从乙醛再氧化为乙酸。这两步代谢反应都是在酶的催化下进行的，前者的酶叫乙醇脱氢酶(ADH)，后者的酶叫乙醛脱氢酶(ALDH)。基因科学家的研究表明，乙醇脱氢酶主要由ADH1B基因编码，乙醛脱氢酶主要由ALDH2基因编码。这两种酶的突变可影响酒精代谢进而引起乙醛等有害物质的堆积，影响身体健康。而乙醛毒性很强，是第一类致癌原。慢代谢的人饮酒后体内乙醛会迅速累积，进而引发脸红、心跳加速、恶心呕吐和头痛等不适反应。研究表明，乙醛慢代谢的人若长期饮酒，消化道癌症如食道癌和肝癌的发病率会显著上升。因此通过检测ADH1B、ALDH2两种基因，能够帮助大家更具体地了解自己的酒精代谢能力，更具体地了解饮酒的健康风险，提前做好预防；同时基因检测还能够更科学更精确地帮助酒精中毒病人确定发病原因；还能够在某些时候帮助实现用药安全，以免在治疗疾病的同时再造成其他疾病的发生。一直以来，硝酸甘油作为首选的一线用药，在临床上被广泛地用作抗心绞痛的治疗，但该药的临床疗效常因人而异。研究显示，中国汉族人群中，硝酸甘油含服无效的比例高达25％以上，而ALDH2基因多态性与部分国人含服硝酸甘油治疗心绞痛无效相关。研究表明乙醛脱氢酶是硝酸甘油在人体内生物代谢的关键酶，ALDH2基因多态性会导致乙醛脱氢酶活性显著降低，从而影响硝酸甘油治疗心绞痛的疗效。因此，检测ALDH2基因型，可以为医生临床使用硝酸甘油提供参考，减少用药无效导致的意外死亡。检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性对硝酸甘油的临床用药及指导人们健康饮酒具有重要的意义。目前已有很多种检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的方法，如测序法、毛细管电泳法、基因芯片法等，但其用于检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性存在操作复杂、易污染、成本高等特点，因此需要建立一种检测特异性和灵敏度高、准确性和精密度好、操作简单、快速、无污染、成本低廉，且可实现多个位点同时检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种同时检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的检测引物探针，以克服现有技术检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性操作复杂、易污染、成本高等问题。本专利技术还要解决的技术问题是提供一种检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的方法。TaqMan-MGB探针法检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的引物，包括如下引物和探针：用于扩增ADH1B基因rs1229984多态性位点的引物：其核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；用于扩增ALDH2基因rs671多态性位点的引物：其核苷酸序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示；检测ADH1B基因rs1229984位点多态性的TaqMan-MGB探针，其核苷酸序列如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示；检测ALDH2基因rs671位点多态性的TaqMan-MGB探针，其核苷酸序列如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示；其中SEQIDNO：5和SEQIDNO：7在5’末端标记Fam信号，SEQIDNO：6和SEQIDNO：8在5’末端标记VIC信号；其中，引物SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和探针SEQIDNO：5、SEQIDNO：6在同一管中共同使用；引物SEQIDNO：3、SEQIDNO：4和探针SEQIDNO：7、SEQIDNO：8在同一管中共同使用。上述TaqMan-MGB探针法检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的引物在检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性中的应用。一种TaqMan-MGB探针法检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的试剂盒，包括权利要求1所述的引物和探针以及如下试剂：2xPCR反应混合液、阳性标准品。其中，所述2xPCR反应混合液的配方如下：PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、Mg2+和dNTPs。其中，所述阳性标准品为AA基因型质粒和GG基因型质粒，AA基因型质粒的插入序列如SEQIDNO：9所示；GG基因型质粒的插入序列如SEQIDNO：10所示。TaqMan-MGB探针法检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的方法，包括如下步骤：(1)模板的准备：提取待测样品DNA；(2)实时荧光定量PCR反应：将以步骤(1)提取的DNA为模板、权利要求1所示的引物和探针进行实时荧光定量PCR扩增反应；(3)结果判读：根据检测到的荧光信号值，在实时荧光定量PCR仪上的“端点基因分型”模式下，根据每个样品点的颜色和对应的基因型，直接判读结果。本专利技术的试剂盒根据ADH1B基因rs1229984位点和ALDH2基因rs671位点的保守基因序列设计引物和探针，保证检测方法的特异性。本专利技术采用TaqMan-MGB探针法实现了对ADH1B基因rs1229984位点和ALDH2基因rs671位点的快速、简单检测。本专利技术检测结果准确，易于判读。与测序法相比，该方法不需要对PCR产物进行一系列复杂的后续处理，PCR扩增和检测同步进行，整个检测过程无需开盖操作，降低了PCR产物造成污染的风险，大大缩短了检测时间，且降低了检测成本。附图说明图1为10例标本ADH1B基因rs1229984位点的检测结果图示；图2为10例标本ALDH2基因rs671位点的检测结果图示。具体实施方式Taqman探针法可用于基因荧光定量分析、甲基化检测、SNP分型、miRNA定量分析等。Taqman探针法SNP分型技术的核心就是特异性的MGB探针技术，已证实的Taqman探针，3’段结合MGB技术，能更好的进行等位基因的区分。MGB分子结合到DNA螺旋小沟，通过稳定MGB探针/模板联合体提高杂交的检验。这种超强的稳定性可使短至13个碱基的探针提高错配的辨别力，并为困难多变的序列设计提供更高的灵活性。所有的MGB探针都包括一个不发荧光的猝灭基团(NFQ)，它能真正消除传统猝灭基团产生的背景荧光，提高信噪比，从而提供检测灵敏性。其具体方法是：针对同一SNP位点的不同基因型设计两条不同的TaqMan-MGB探针，把它们同时加入到PCR反应体系中，只有与靶序列完全匹配的探针才能被水解并释放出荧光信号。两条探针分别标记不同的荧光基团，分别用实时荧光定量PCR仪中对应的荧光检测通道检测荧光信号。某种基因型对应的荧光探针能够释放荧光信号，说明在原始DNA样本中含有该种基因型。如果只有一条探针能释放荧光信号，那么检测到SNP位点上是纯合子，如果两条探针都有荧光信号，那么在该SNP位点上是杂合子。该方法可以直接在实验结果中读出每个样本中SNP的基因型，不需要再对序列进行分析，具有直观性。基于上述原理，本专利技术提供的TaqMan-MGB探针法同时检测ADH1B基因和本文档来自技高网...

【技术保护点】
TaqMan‑MGB探针法检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的引物，其特征在于，包括如下引物和探针：用于扩增ADH1B基因rs1229984多态性位点的引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；用于扩增ALDH2基因rs671多态性位点的引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；检测ADH1B基因rs1229984位点多态性的TaqMan‑MGB探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；检测ALDH2基因rs671位点多态性的TaqMan‑MGB探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；其中SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7在5’末端标记Fam信号，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8在5’末端标记VIC信号；其中，引物SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和探针SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6在同一管中共同使用；引物SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和探针SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8在同一管中共同使用。...

【技术特征摘要】
1.TaqMan-MGB探针法检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的引物，其特征在于，包括如下引物和探针：用于扩增ADH1B基因rs1229984多态性位点的引物：其核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；用于扩增ALDH2基因rs671多态性位点的引物：其核苷酸序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示；检测ADH1B基因rs1229984位点多态性的TaqMan-MGB探针，其核苷酸序列如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示；检测ALDH2基因rs671位点多态性的TaqMan-MGB探针，其核苷酸序列如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示；其中SEQIDNO：5和SEQIDNO：7在5’末端标记Fam信号，SEQIDNO：6和SEQIDNO：8在5’末端标记VIC信号；其中，引物SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和探针SEQIDNO：5、SEQIDNO：6在同一管中共同使用；引物SEQIDNO：3、SEQIDNO：4和探针SEQIDNO：7、SEQIDNO：8在同一管中共同使用。2.权利要求1所述TaqMan-MGB探针法检测ADH1B基因和ALD...

【专利技术属性】
技术研发人员：任绪义，罗英，张锋，周韵，
申请(专利权)人：杭州迪安医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33