本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体涉及一种DPYD基因多态性的引物及其检测方法。本发明专利技术提供的DPYD基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物。本发明专利技术提供的DPYD基因多态性的引物具有特异性好，不会发生交叉反应，准确性高的优点，实现了DPYD基因多态性的检测，可以对肿瘤患者进行有效的药物敏感指导，提高药物的清除率、肿瘤的反应性及患者的毒性反应，为实现肿瘤患者个体化治疗提供了依据，更有利于肿瘤患者的康复。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种DPYD基因多态性的引物及其检测方 法。
技术介绍
二氢啼啶脱氢酶（dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD)编码基因是位于 1 号 人类染色体的短臂上（lq22)，基因全长约150kb，含有3kb的编码序列，其由23个外显子构 成，长度从69bp到1404bp，基因中内含子由长短不等的序列组成。二氢嘧啶脱氢酶是作用于 5-FU药物代谢途径的关键酶之一，是分解代谢的限速酶，其含量的高低决定了5-FU药物的 代谢速度，进而影响体内药物的毒性和疗效。 5-Fu及其前体药物卡培他滨广泛用于肿瘤化疗，80%以上的5-Fu及其前体药物是 通过DH)代谢降解为无活性代谢物二氢氟尿嘧啶(FUH2)而失活。不同个体间DPD酶活性存在 明显差别，导致药物清除率、肿瘤的反应性及患者的毒性反应存在明显的个体差异性。 DPYD突变会影响DPD酶活性的改变，DPYD *2 (IVS14+1G>A)是最常见的突变之 一，与DPD酶活性相关。DPYD *2在西欧人群中突变频率较高，约占0.005~3.5%，在中国北方 汉族人群及中国重庆地区人群的研究中均未发现该类型的突变。中国北方人群的研究发现 DPYD *9(外显子2，T85C)的突变频率较高（11.25%)。近年来发现位于外显子13的〇.16791'>6 (DPYD * 13)突变可能有较大的毒性，但突变频率较低。因此，检测DPYD基因多态性可以对肿 瘤患者进行药物敏感指导，提高治疗效果，降低药物的毒副作用。 中国专利CN102146440B公开了一种甄别DPYD基因*9A突变位点的PCR检测试剂盒， 所述试剂盒主要包括特异性引物、Eva Green荧光染料、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物 和DNA聚合酶。该实时荧光PCR检测方法可以实现二氢嘧啶脱氢酶基因*9A突变位点快速、准 确、特异分析。但是，但其高居不下的假阳性率为实际应用所诟病，而且该检测方法还存在 检测通量少，每次只能检测一种突变类型的缺陷，不能满足实际应用的需要。 中国专利CN102952866B公开了一种DPYD基因多态性检测特异性引物和液相芯片， 该液相芯片包括野生型和突变型ASPE引物，每种ASPE引物由5 '端的tag序列和3 '端针对目 的基因多态性位点的特异性引物序列组成。该液相芯片可用于并行或单项检测DPYD基因三 种常见基因型G55A、G141A和G134T的野生型和突变型。但是，上述检测方法操作复杂，不利 于大规模的推广和应用。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的缺陷，本专利技术提供一种DPYD基因多态性的引物及其检 测方法，该引物主要用于检测DPYD基因的DPYD*2 (c . 1905+1G>A/C)、DPYD*9A(c . 85T>C)、 DPYD*13(c.l679T>G)、DPYD*9B(c.2846A>T)四个位点，具有特异性强、检测灵敏度高、准确 性好等优点，为DPYD基因多态性提供了 一种简单有效的检测方法。 本专利技术提供了一种DPYD基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引 物;所述PCR扩增引物包括:针对DPYD*2的上游引物5 ' - ATCAGTGAGAAAACGGCTGC-3 '（SEQ ID N0.1)和下游引物5'- TAAACATTCACCAACTTATGCCA-3'（SEQ ID N0.2)，针对DPYD*13的上游 弓丨物5'- CAAGCCTGAACTACCCCTCT-3'（SEQ ID N0.3)和下游弓丨物5'_ CCTTATCAAGAGAGAAAGTTTTGGT-3'（SEQ ID N0.4)，针对DPYD*9A的上游引物5'-CTGTCTTTAGAGTATCCTGGCTTT-3'（SEQ ID N0.5)和下游弓丨物5'-CTTACAATGTGTGGAGTGAGGTA-3 '（SEQ ID NO · 6 )，针对 DPYD*9B的上游弓| 物5 '-GCTTGCTAAGTAATTCAGTGGCTAT-3'（SEQ ID N0.7)和下游弓丨物5'-AGCATTCTAATTCCAGCAGGATTC-3'（SEQIDN0·8);所述SNaPshotPCR引物包括 ：针对DPYD*2 的SNaPshotPCR引物5'-GCTGACTTTCCAGACAAC-3'（SEQIDN0·9)，针对DPYD*13的SNaPshot PCR引物5'- TTTCCATCCAGCTTCAAAAGCTCTTCGA-3'（SEQ ID 腸.10)，针对0卩丫0*9八的 SNaPshot PCR引物5'- TTTTTTTTTTTTTTTTTTAACACAAACTCATGCAACTCTG-3'（SEQ ID NO. 11)，针对 DPYD*9B 的 SNaPshot PCR 弓| 物5'_ TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGCAAGTTGTGGCTATGATTG_ 3'（SEQ ID N〇.12)。 进一步地，所述PCR扩增引物中DPYD*2、DPYD* 13、DPYD*9A和DPYD*9B的引物浓度比 为 1:1:1:1，所述SNaPshot PCR 引物中 DPYD*2、DPYD* 13、DPYD*9A和DPYD*9B的引物浓度比为 1:1:1:1〇 另外，本专利技术还提供了一种DPYD基因多态性的检测方法，包括如下步骤： S1提取DNA样品； S2以步骤S1提取的DNA样本为模板，采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR 扩增，并对扩增产物进行纯化； S3以步骤S2纯化后的PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的SNaPshot PCR引物 进行SNaPshot PCR扩增，并对SNaPshot PCR扩增产物进行纯化； S4采用毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。 进一步地，所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。 进一步地，所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括:阶段1:98°C 3min;阶段2: 98°C 10s;阶段3:58°C 30s;阶段4:72°C lmin;阶段5:返回到阶段2,29个循环;阶段6:72°C 5min;阶段7:25°C保温。 进一步地，所述步骤S3中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括:阶段1:96°C 10s;阶 段2:55°C 5s;阶段3:60°C 30s;阶段4:返回到阶段1，25个循环;阶段5:4°C保温。 进一步地，所述步骤S4中采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。 除此之外，本专利技术提供的所述的DPYD基因多态性的引物在制备检测DPYD基因多态 性试剂中的用途。 与现有技术相比，本专利技术提供的技术方案具有以下优势:本专利技术提供的DPYD基因 多态性的引物具有特异性好，不会发生交叉反应，准确性高的优点，实现了 DPYD基因多态性 的检测，可以对肿瘤患者进行有效的药物敏感指导，提高药物的清除率、肿瘤的反应性及患 者的毒性反应，为实现肿瘤患者个体化治疗提供了依据，更有本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种DPYD基因多态性的引物，其特征在于：包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对DPYD*2的上游引物5’‑ ATCAGTGAGAAAACGGCTGC‑3’和下游引物5’‑ TAAACATTCACCAACTTATGCCA‑3’，针对DPYD*13的上游引物5’‑ CAAGCCTGAACTACCCCTCT‑3’和下游引物5’‑ CCTTATCAAGAGAGAAAGTTTTGGT‑3’，针对DPYD*9A的上游引物5’‑ CTGTCTTTAGAGTATCCTGGCTTT‑3’和下游引物5’‑ CTTACAATGTGTGGAGTGAGGTA‑3’，针对DPYD*9B的上游引物5’‑ GCTTGCTAAGTAATTCAGTGGCTAT‑3’和下游引物5’‑ AGCATTCTAATTCCAGCAGGATTC‑3’；所述SNaPshot PCR引物包括：针对DPYD*2的SNaPshot PCR引物5’‑GCTGACTTTCCAGACAAC‑3’，针对DPYD*13的SNaPshot PCR引物5’‑ TTTCCATCCAGCTTCAAAAGCTCTTCGA‑3’，针对DPYD*9A的SNaPshot PCR引物5’‑ TTTTTTTTTTTTTTTTTTAACACAAACTCATGCAACTCTG‑3’，针对DPYD*9B的SNaPshot PCR引物5’‑ TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGCAAGTTGTGGCTATGATTG‑3’。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梁耀铭，于世辉，赵薇薇，燕启江，胡昌明，罗锦霞，
申请(专利权)人：广州金域检测科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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