DMGDH基因多态性检测用试剂体系和试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及二甲基甘氨酸脱氢酶基因多态性检测用试剂体系和试剂盒及其应用，所述试剂体系或试剂盒包括特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及能够作用于SEQ ID NO.3所示序列的第301位与第302位之间的限制性内切酶。本发明专利技术所述试剂盒的使用方法包括(1)获取样本DNA；(2)利用特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2对步骤(1)获取的样本DNA进行PCR扩增；(3)利用限制性内切酶与步骤(2)的扩增产物进行酶切反应；(4)将步骤(3)的反应产物进行电泳。通过分析电泳条带，确定样本DNA的基因型，判断样本DNA提供者的硒吸收情况。本发明专利技术提供的试剂盒制备方法简单，该试剂盒的使用简便，速度快，检测结果准确、直观，灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
DMGDH基因多态性检测用试剂体系和试剂盒及其应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种二甲基甘氨酸脱氢酶(DMGDH)基因多态性检测用试剂体系和试剂盒及其应用。
技术介绍
微量元素硒能提高人体免疫机能，防癌抗癌，预防心脑血管疾病，保护肝脏，抗氧化、延缓衰老，参与糖尿病的治疗，保护、修复细胞，保护眼睛，提高红细胞的携氧能力，解毒、防毒、抗污染。硒缺乏主要表现为脱发、脱甲，部分患者出现皮肤症状，少数患者可出现神经症状及牙齿损害。人轻度或中度缺硒，其症状不明显。人体缺硒会导致的疾病有：能量缺乏性营养不良，血溶性贫血，克山病，高血压，缺血性心脏病，不妊娠，糖尿病等。十二指肠是硒吸收的主要部位之一。硒由胃肠道吸收进入血液后，首先与球蛋白结合，也可结合于血浆高密度或低密度脂蛋白，进而由血浆运载进入各组织。肝、胰、肾、垂体及毛发内含硒较高，肌肉、骨胳、血液较低，脂肪组织最低。硒能够增强人体的抗癌能力和提高自身免疫力。在满足营养需要的情况下，每天补充100微克硒，对免疫功能具有显著的刺激作用，淋巴细胞和中性细胞的生成量可大量增加。这两种细胞都具有破坏肿瘤细胞的作用。根据流行病学调查，补硒对减少前列腺癌、肺癌和肝癌的发生作用最为明显。硒还能防止人体免疫力低下。在每天服200微克硒制剂的人群中，癌症总死亡率降低了50％，总发病率降低了37％。其中，前列腺癌的发病率降低了63％；结肠癌的发病率降低了58％；肺癌的发病率降低了46％。DMGDH是二甲基甘氨酸脱氢酶(dimethylglycinedehydrogenase)，可以控制肌氨酸在细胞中的水平，其缺陷或变异会导肌氨酸血症或肌氨酸尿症，且该基因在前列腺癌发生侵袭过程中扮演关键角色。rs921943是DMGDH基因上的一个单核苷酸多态性(SNP)位点，研究表明DMGDH基因的单核苷酸多态性与血硒浓度密切相关，其变异会使人血硒含量变化，影响人体新陈代谢。目前检测单核苷酸多态性的常用方法有PCR-RFLP、基因芯片，sanger测序等方法。PCR-RFLP操作复杂耗时，并且结果可信度差。PCR-RFLP扩增条件要求严格，操作繁琐。基因芯片快速高效，但其造价高。Sanger测序费用较高，且杂合体不易分型。现有技术中，尚未有能够准确、方便且特异性检测基因多态性的方法。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是：硒吸收情况难以预测，现有技术中检测基因单核苷酸多态性的方法灵敏度低、准确度低且操作不方便；尚未有能够准确、方便且特异性检测DMGDH基因单核苷酸多态性的试剂体系和试剂盒。本专利技术的目的是提供一种DMGDH基因单核苷酸多态性检测用试剂体系和试剂盒，通过确定单核苷酸多态性来判断硒吸收情况；利用所述试剂盒检测DMGDH基因单核苷酸多态性的灵敏度高、准确度高、特异性强，操作简单，结果直观，实用性强。具体来说，针对现有技术的不足，本专利技术提供了如下技术方案：一方面，本专利技术提供了一种二甲基甘氨酸脱氢酶基因多态性检测用试剂体系，所述试剂体系包括特异性引物和限制性内切酶，所述特异性引物如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述限制性内切酶的酶切位点为SEQIDNO.3所示序列的第301位与第302位之间。优选的，所述限制性内切酶包括SspI酶。优选的，所述试剂体系还包括缓冲液和dNTPs，所述缓冲液的组成包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钾和氯化镁。优选的，所述试剂体系还包括DNA聚合酶，优选TaqDNA聚合酶。另一方面，本专利技术还提供了一种二甲基甘氨酸脱氢酶基因多态性检测用试剂盒，所述试剂盒包含前述的试剂体系。再一方面，本专利技术提供了特异性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2以及酶切位点为SEQIDNO.3所示序列的第301位与第302位之间的限制性内切酶在制备二甲基甘氨酸脱氢酶基因多态性检测用试剂体系或试剂盒中的应用。优选的，所述二甲基甘氨酸脱氢酶基因多态性检测用试剂体系或试剂盒的使用方法包括以下步骤：(1)获取样本DNA；(2)利用特异性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2对步骤(1)获取的样本DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；(3)利用酶切位点为SEQIDNO.3所示序列的第301位与第302位之间的限制性内切酶与步骤(2)的扩增产物进行酶切反应；(4)将步骤(3)的反应产物进行电泳。优选的，在所述的应用中，所述限制性内切酶包括SspI酶。优选的，步骤(2)得到的扩增产物序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示。优选的，步骤(3)所述的酶切反应温度为37～39℃中的任一种温度，恒温反应3～5小时。与现有技术相比，本专利技术的效果和益处在于：本专利采用限制性内切酶的方法检测DMGDH基因上的单核苷酸多态性，采用SspI内切酶进行酶切，准确性高，特异性好，假阳性假阴性率低，操作简单方便，仪器设备要求低，适应性广。通过DMGDH基因上的单核苷酸多态性检测能够有效判断硒吸收情况。附图说明图1为实施例2的琼脂糖凝胶电泳图；其中，左起第一组条带为DNAmarker；左起第二组含有1个条带，DNA长度为408bp；左起第三组共含有3个条带，其中DNA长度分别为408bp、301bp和107bp；左起第四组共含有2个条带，其中DNA长度分别为301bp和107bp。具体实施方式目前市场上儿童补硒的产品很多，但补充硒后儿童能不能很好的吸收硒也至关重要。DMGDH基因上的一个单核苷酸多态性位点rs921943的多态性与硒吸收高度相关，通过确定rs921943位点的核苷酸序列可以有效判断硒吸收情况。本专利技术采用限制性内切酶法检测经处理的样本DNA中的rs921943位点的碱基序列，准确性高，特异性好，假阳性假阴性率低，操作简单方便，仪器设备要求低，适应性广。本专利技术提供了一种二甲基甘氨酸脱氢酶(DMGDH)基因多态性检测用试剂体系和试剂盒，所述试剂体系包括特异性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，以及酶切位点在SEQIDNO.3所示序列的第301位与第302位之间的限制性内切酶，优选SspI内切酶。试剂体系中还有由三羟甲基氨基甲烷、氯化钾和氯化镁组成的缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶。本专利技术还提供了二甲基甘氨酸脱氢酶基因多态性检测用试剂或试剂盒的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：(1)获取样本DNA；(2)利用特异性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2对步骤(1)获取的样本DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；(3)利用限制性内切酶SspI内切酶与步骤(2)的扩增产物进行酶切反应；(4)将步骤(3)的反应产物进行电泳。在一优选实施方式中，试剂体系中的缓冲液组成为100～150mM三羟甲基氨基甲烷，400～600mM氯化钾和15～25mM氯化镁。试剂体系中的DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。在另一优选实施方式中，获取样本DNA的方法为：取口腔粘膜拭子，在口腔内侧反复擦拭二十下，取出拭子折下棉絮部分，置于装有150～200μLChelex100液的1.5mL离心管中，用Chelex100液浸没标本，再加入蛋白酶K(20mg/mL)20～50μL，漩涡混匀。然后50℃水浴消化过夜，煮沸10～25min，置于冰上静置3min，以12,000r/min离心2～5min，取上清液得到样本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种二甲基甘氨酸脱氢酶基因多态性检测用试剂体系，其特征在于，所述试剂体系包括特异性引物和限制性内切酶，所述特异性引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述限制性内切酶的酶切位点为SEQ ID NO.3所示序列的第301位与第302位之间。

【技术特征摘要】
1.一种二甲基甘氨酸脱氢酶基因多态性检测用试剂体系，其特征在于，所述试剂体系包括特异性引物和限制性内切酶，所述特异性引物如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述限制性内切酶的酶切位点为SEQIDNO.3所示序列的第301位与第302位之间。2.根据权利要求1所述的试剂体系，其特征在于，所述限制性内切酶包括SspI酶。3.根据权利要求1或2所述的试剂体系，其特征在于，所述试剂体系还包括缓冲液和dNTPs，所述缓冲液的组成包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钾和氯化镁。4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂体系，其特征在于，所述试剂体系还包括DNA聚合酶，优选TaqDNA聚合酶。5.一种二甲基甘氨酸脱氢酶基因多态性检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-4任一项所述的试剂体系。6.特异性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2以及酶切位点为SEQIDNO.3所示序列的第301位与第302位之间的限制性...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘鹏飞，徐莲，韩雪，
申请(专利权)人：天津脉络医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12