一种中药植物叶片基因组DNA的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种中药植物叶片基因组DNA的提取方法，涉及分子生物学实验中植物基因组DNA分离提取技术。本方法主要包括预处理组织样品，细胞的破碎，杂质的洗脱，DNA的析出，离子的去除。本发明专利技术具有下列优点和积极效果：①用刀切的方法从细胞壁中释放出的细胞核，然后洗脱出次生代谢产物，得到纯净的细胞核，最后从细胞核中提取基因组DNA；②刀切的方法提取细胞核可以不使用液氮；③反复的洗脱细胞质中的杂质，可以有效得到纯净细胞核；④能从长期低温存储的样品和新鲜叶片中都得到样品；⑤适用于所有中药植物叶片DNA的提取。适用于中药植物叶片基因组DNA的提取。

【技术实现步骤摘要】
一种中药植物叶片基因组DNA的提取方法
本专利技术涉及分子生物学实验中植物基因组DNA分离提取技术，尤其涉及一种中药植物叶片基因组DNA的提取方法。
技术介绍
基因组DNA提取是分子生物学实验中的重要环节之一。基因组DNA的质量和产量，直接影响分子生物实验中与DNA有关的后续实验的进行。中药植物中含有大量的次生代谢产物，特别是淀粉、多酚和多糖等物质严重影响了提取DNA的质量。这类植物中的次生代谢产物种类复杂，而且不同物种间，甚至同一物种间不同季节的次生代谢产物的异质性程度都很高。因此，一种中药植物的基因组提取方法往往不能很好地应用于另一种中药基因组DNA的提取。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，针对中药材植物的次生代谢产物，如淀粉、多酚和多糖等存在于细胞核外的细胞质的特点，提供一种中药植物叶片基因组DNA的提取方法。本方法的目的是这样实现的：先提取纯净无杂质的细胞核，然后再提取基因组DNA。具体地说，本方法包括下列步骤：①将0.1-0.5克组织样品放在冰冷细胞核提取缓冲液中，用锋利的手术刀将组织切碎至极小的匀浆状混合液；②将匀浆混合液用18-50μm孔径的尼龙膜过滤到离心管中；③6000-15000rpm高速离心10-100秒，去除上清液，沉淀物为细胞核，再次加入冰冷细胞核提取缓冲液重悬沉淀；④重复步骤③1-5次；⑤将清洗干净的细胞核重悬于3mL细胞核裂解液中，振荡至匀，加入25μL20mg/mL蛋白酶K，振荡至匀，加入300μL20%SDS（sodiumdodecylsulfate,sodiumsalt，十二烷基硫酸钠），摇匀，至出现粘稠状，37℃消化过夜；⑥加入6mL饱和酚于15mL离心管中，将过夜的消化液加入此离心管，轻摇混匀，4℃，3000rpm离心10分钟；⑦加等体积酚／氯仿各3mL至另一15mL离心管，小心移取步骤⑥的上清至此离心管，混匀，4℃，3000rpm离心10分钟；⑧加6mL氯仿于15mL离心管中，小心移取步骤⑦的上清至此离心管，混匀，4℃，3000rpm离心10分钟；⑨加10mL无水乙醇于另一15mL离心管，小心移取步骤⑧的上清至此离心管，混匀，见白色絮状DNA；⑩13000rpm离心3分钟后，去上清，用500μL70%乙醇清洗，13000rpm离心5分钟，再室温干燥DNA沉淀5分钟，将DNA溶解即可；所述的的细胞核提取缓冲液：0.01MMgSO4，0.005MKCl，0.0005MHEPES，1mg/mLdithiothreitol，0.25%TritonX-100；所述的细胞核裂解液：2MTris-HCl，pH8.2，0.5mL；4MNaCl10mL；2mMEDTA0.4mL；加dH2O至100mL高压灭菌，4℃保存。2、中药植物叶片基因组DNA的鉴定本方法提取的基因组DNA样品，经0.8%的琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop检测其浓度和质量。工作机理：中药植物叶片中富含大量的次生代谢产物如淀粉、多酚和多糖等，而且这些次生代谢产物是存在于细胞核外的细胞质中，首先用刀切的方法从细胞壁中释放出细胞核，然后洗脱出次生代谢产物，得到纯净的细胞核，最后从细胞核中提取基因组DNA。本专利技术的优点和积极效果。①用刀切的方法从细胞壁中释放出的细胞核，然后洗脱出次生代谢产物，得到纯净的细胞核，最后从细胞核中提取基因组DNA；②刀切的方法提取细胞核可以不使用液氮；③反复的洗脱细胞质中的杂质，可以有效得到纯净细胞核；④能从长期低温（-70℃）存储的样品和新鲜叶片中都得到样品；⑤适用于所有中药植物叶片DNA的提取。附图说明图1是两个灯盏花样品经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测到的电泳条带图片，左：-70℃灯盏花样品；中：新鲜灯盏花样品；右：DNAmarker。具体实施方式：下面结合附图和实施例详细说明：以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例11、提取方法选取-70℃存储一年和新鲜的灯盏花叶片各0.3克；1）将0.3克样品分别放在冰冷细胞核提取缓冲液中，用锋利的手术刀将组织切碎至极小的匀浆状混合液；2）将匀浆混合液用18-50μm孔径的尼龙膜过滤到离心管中；3）6000-15000rpm高速离心10-100秒，去除上清液，沉淀物为细胞核，再次加入冰冷细胞核提取缓冲液重悬沉淀。4）重复步骤3），1-5次；5）将清洗干净的细胞核重悬于3mL细胞核裂解液中，振荡至匀，加入25μL20mg/mL蛋白酶K，振荡至匀，加入300μL20%SDS，摇匀，至出现粘稠装，37℃消化过夜；6）加入6mL饱和酚于15mL离心管中，将过夜的消化液加入此离心管，轻摇混匀，4℃，3000rpm离心10分钟；7）加等体积酚／氯仿（各3mL）至另一15mL离心管，小心移取步骤6）的上清至此离心管，混匀，4℃，3000rpm离心10分钟；8）加6mL氯仿于15mL离心管中，小心移取步骤7）的上清至此离心管，混匀，4℃，3000rpm离心10分钟；9）加10mL无水乙醇于另一15mL离心管，小心移取步骤8）的上清至此离心管，混匀，见白色絮状DNA；10）13000rpm离心3分钟后，去上清，用500μL70%乙醇清洗，13000rpm离心5分钟。2、如图1所示，两个灯盏花样品经0.8%的琼脂糖凝胶电泳均可检测到清晰而且明亮的电泳条带。3、Nanodrop检测两个灯盏花样品的质量见表格一。结果显示，两种样品的DNA纯度很高。表格一Nanodrop检测DNA质量A260/A280A260/A230-70℃样品1.802.10新鲜样品1.812.12本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中药植物叶片基因组DNA的提取方法，其特征在于：①将0.1‑0.5克组织样品放在冰冷细胞核提取缓冲液中，用锋利的手术刀将组织切碎至极小的匀浆状混合液；②将匀浆混合液用18‑50μm孔径的尼龙膜过滤到离心管中；③6000‑15000rpm高速离心10‑100秒，去除上清液，沉淀物为细胞核，再次加入冰冷细胞核提取缓冲液重悬沉淀；④重复步骤③1‑5次；⑤将清洗干净的细胞核重悬于3mL细胞核裂解液中，振荡至匀，加入25 μL 20mg/mL蛋白酶K，振荡至匀，加入300μL 20%SDS，摇匀，至出现粘稠状，37℃消化过夜；⑥加入6mL饱和酚于15mL离心管中，将过夜的消化液加入此离心管，轻摇混匀，4℃，3000rpm离心10分钟；⑦加等体积酚／氯仿各3mL至另一15mL离心管，小心移取步骤⑥的上清至此离心管，混匀，4℃，3000rpm离心10分钟；⑧加6mL氯仿于15mL离心管中，小心移取步骤⑦的上清至此离心管，混匀，4℃，3000rpm离心10分钟；⑨加10mL无水乙醇于另一15mL离心管，小心移取步骤⑧的上清至此离心管，混匀，见白色絮状DNA；⑩13000rpm离心3分钟后，去上清，用500μL 70%乙醇清洗，13000rpm离心5分钟，再室温干燥DNA沉淀5分钟，将DNA溶解即可；所述的的细胞核提取缓冲液：0.01 M MgSO...

【技术特征摘要】
1.一种中药植物叶片基因组DNA的提取方法，其特征在于：①将0.1-0.5克组织样品放在冰冷细胞核提取缓冲液中，用锋利的手术刀将组织切碎至极小的匀浆状混合液；②将匀浆混合液用18-50μm孔径的尼龙膜过滤到离心管中；③6000-15000rpm高速离心10-100秒，去除上清液，沉淀物为细胞核，再次加入冰冷细胞核提取缓冲液重悬沉淀；④重复步骤③1-5次；⑤将清洗干净的细胞核重悬于3mL细胞核裂解液中，振荡至匀，加入25μL20mg/mL蛋白酶K，振荡至匀，加入300μL20%SDS，摇匀，至出现粘稠状，37℃消化过夜；⑥加入6mL饱和酚于15mL离心管中，将过夜的消化液加入此离心管，轻摇混匀，4℃，3000rpm离心10分钟；⑦加等体积酚／氯仿各3mL至另一15mL离心管，小心移取步骤⑥的上清至此离心管...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡军军，马璐，
申请(专利权)人：深圳市斐仕生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44