HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法技术

本发明专利技术公开了一种HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法，引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；所述方法包括：抽提样品的基因组DNA；提供扩增人PTEN基因多态性rs701848位点附近序列的正向引物和反向引物，以提取的待测基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；使用限制性内切酶HaeIII对获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定PTEN基因多态性rs701848的各基因型。本发明专利技术简单易行，快速高效，成本低廉，酶切结果容易辨识，为食管癌易感基因PTEN多态性rs701848的基因分型提供了简捷途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因多态性检测
，尤其涉及一种HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法。
技术介绍
目前，单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是人类长期进化过程中环境选择的结果，已成为第3代分子遗传的标记，具有标记密度高、稳定、易于分型检测的优势，是人种之间、个体之间差异的遗传基础之一，已确定为多种遗传学相关疾病的易感基础，成为患病危险程度的评价指标。PCR-RFLP(PolymeraseChainReactionrestrictionfragmentlengthpolymorphisms)是一种模拟体内DNA复制过程的体外酶促合成特异性核苷酸片段技术，它以待扩增的两条DNA链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸作为介导，通过DNA聚合酶反应，在体外进行特异DNA序列扩增，扩增后将PCR产物进行酶切、电泳、显色，即可对目的基因进行分类分型，方法比较简单，易于操作，成本低，因此在大样本的基因流行病学研究中最为常用。此项技术大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，而且方法简便，分型时间短。这种方法与RFLP相比，不同的是以扩增替代了酶切，避免了RFLP繁琐的DNA酶切、转移、杂交等步骤。食管癌是世界第六大常见恶性肿瘤死因，在特殊地区的发病率呈上升趋势。我国的食管癌发病率居世界首位，食管癌死因在全国恶性肿瘤死因中位居第四，死亡人数占全国恶性肿瘤死亡人数的1/5。近年的研究表明，食管癌的发生和发展是多因素共同作用的结果，其发生和发展除与长期吸烟、饮酒、亚硝胺类及霉菌的摄人、膳食中缺乏维生素及微量元素(如钼)、热损伤(喜食烫食)等环境因素有关外，与个体遗传易感性也有密切关系。PTEN(phosphataseandtensinhomologydeletedonchromosometen)是一种新的抑癌基因，通过在PI3K信号传导通路中发挥负向调节作用从而起到抑癌基因的作用。PTEN可以抑制细胞生长，促进凋亡，并且可以调节细胞的粘附、迁移、扩散和分化。已经在许多肿瘤中都发现了PTEN活性的丢失。细胞核PTEN表达可能是食管癌的一个生物标记，并且在致癌作用和食管癌的进展中发挥着重要作用。MicroRNA(miRNA)为长度大约22个碱基左右非编码的单链RNA，通过非特异结合基因3’UTR区抑制基因表达，从而在癌症的发生中发挥作用。MiRNA通过沉默转录后的mRNA从而达到调控癌症发生。MiRNA与靶基因结合位点的多态性，可以破坏或者增加miRNA与靶基因的结合。近年来miRNA靶位点SNP在肿瘤领域的研究取得了较大进展，但其在食管癌领域的研究开展相对较少，因此将一定功能相关的在PTEN基因上miRNA靶位点多态性与食管癌结合起来可以更好的探讨其对食管癌形成过程的作用，揭示其与食管癌发生的关联性进而探讨其中的具体分子机制。序列特异性引物PCR也称等位基因特异性PCR(AS-PCR)，它的原理是基于TaqDNA多聚酶不能修复DNA引物在3′末端的单个碱基错配。所以，当引物的3′端核苷酸与等位基因变异部位序列互补，则模板被扩增。但是，当引物3′端核苷酸与模板错配，则模板不会被扩增或扩增效率极低。每个等位基因的检测，需设计两套引物，一套为等位基因特异性引物，一套为普通引物。PCR产物凝胶电泳以后，通过紫外线透射来检测DNA的存在与否，DNA条带的存在或缺失即可确定基因型。在同一反应中的另一对引物(通常扩增人生长激素基因的一段)总会产生一个DNA片断，与SNP基因型无关，作为PCR有效性的控制。基因特异性PCR(AS-PCR)的缺点是扩增效率较低，扩增特异性差，因此PCR产物的特异性与稳定性无法保障，同时，分型结果也较容易误判，稳定性较差。TaqMan探针法是指PCR扩增时，在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。Taqman荧光探针法需要昂贵的仪器和较长的步骤，成本较高，难以在实验室中普及使用。SNaPshot也被称为minisequencing。该方法针对不同突变位点设计不同长度的引物SNaPshot反应后，产物通过电泳分离、五色荧光检测、Genemapper分析，可在一次电泳胶内检测多个SNP位点。应用SNaPshot进行定点的序列分析，其基本原理遵循了DNA直接测序中的双脱氧终止法，所不同的是PCR反应中只有不同荧光标记的ddNTP。由于每个SNP位点的引物3′端都紧靠SNP点，因此每一种引物在聚合酶作用下，根据模板的序列，只延伸一个核苷酸。然后用先进的荧光检测系统，检测延伸的那个核苷酸的种类。SNaPshot基因型分析方法的缺点在于所需试剂必须从国外进口，而且成本较高，不适合实验室应用。综上所述，为了最终实现降低食管癌的发病率，本领域迫切需要食管癌易感基因miRNA靶位点SNP检测，并开发操作简单、成本低、适用范围广泛的检测食管癌易感基因多态性的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术旨在解决现有的食管癌易感基因多态性检测方法，克服操作复杂、需昂贵的仪器和繁琐的步骤、检测成本较高、适用范围小、难以在实验室中普及使用的问题。本专利技术是这样实现的，一种引物，所述引物为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述引物的HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法，所述HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法包括以下步骤：步骤一，抽提样品的基因组DNA；步骤二，提供扩增人PTEN基因多态性rs701848位点附近序列的正向引物和反向引物，rs701848上游引物:5’-GTGCAGTGTTGAATCATTTC-3’，rs701848下游引物:5’-GGTCCTATTCAATCTGTATTTG-3’，以提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；步骤三，使用限制性内切酶对获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；步骤四，将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定PTEN基因多态性rs701848的各基因型；其中，经电泳后有一条条带者为TT基因型，两条条带者为CC基因型，三条条带者为TC基因型。进一步，所述PCR扩增体系的反应条件包括：在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种引物，其特征在于，所述引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

【技术特征摘要】
1.一种引物，其特征在于，所述引物序列为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。2.一种利用权利要求1所述引物的HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法，其特征在于，所述HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法包括以下步骤：步骤一，抽提样品的基因组DNA；步骤二，提供扩增PTEN基因多态性rs701848位点附近序列的正向引物和反向引物，rs701848上游引物:5’-GTGCAGTGTTGAATCATTTC-3’，rs701848下游引物:5’-GGTCCTATTCAATCTGTATTTG-3’，以提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；步骤三，使用限制性内切酶HaeIII对获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；步骤四，将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定PTEN基因多态性rs701848的各基因型；其中，经电泳后有一条条带者为TT基因型，两条条带者为CC基因型，三条条带者为TC基因型。3.如权利要求2所述的HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法，其特征在于，所述PCR扩增体系的反应条件包括：在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在94℃变性，再迅速冷却至57.9℃，引物退火并结合到靶序列上，然后升温至72℃。4.如权利要求2所述的HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法，其特征在于，所述HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法的具体步骤如下：(l)获取手术切取的食管癌组织，采用酚-氯仿法提取食管癌组织的基因组DNA作为待测DNA，提取步骤如下：1)将食管癌组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取0.1g的组织进行碾磨，加入1ml的灭菌水，颠倒混匀，10000rpm离心10min，弃上清，以上步骤重复两次；2)加入200μl的DNA裂解液，5μl的蛋白酶K混匀，55℃水浴消化过夜；3)消化完成后加入等体积的酚氯仿混合液1:1，剧烈震荡，变成奶咖色；12000rpm离心10min；4)取上清时避免触及中间介质以及下层液体，加入等体积的氯仿后颠倒混匀，12000rm离心10min；5)取上清，加入1/10的醋酸钠以及2.5倍的无水乙醇，颠倒混匀，12000rpm离心10min，弃上清，6)加入1ml70％乙醇，使其白色沉淀悬浮，颠倒混匀数次，12000rpm离心10min，弃上清，室温静置5-10min使乙醇挥发干净；7)加入50μl灭菌水溶解DNA，即得食管癌组织基因组DNA；(2)碱基序列信息从NCBI的dbSNP数据库获取，在CHIP网站上进行核对，明确准确无误后采用PrimerPremier6.0设计各位点引物，结合退火温度、GC含量以及Pubmed中的Blast序列比对结果信息筛选出最优引物为正向引物序列：5’-GTGCAGTGTTGAATCATTTC-3’,下游引物:5’-GGTCCTATTCAATCTGTATTTG-3’，进行PCR引物扩增，制备PCR扩增体系：2×TaqPCRMix7.5μl，双蒸水5.9μl，上游引物0.3μl，下游引物0.3μl以及模板DNA1.0μl，充分混匀后即得15.0μlPCR扩增反应体系；按照第一阶段：94℃变性5min，第二阶段共包括30个循环三个步骤，首先94℃变性30s，57.9℃退火45s，最后72℃延伸45s，第三阶段：72℃延伸5min，最终4℃储存以备用，即得长为344bp的PCR扩增产物；(3)扩增后的SNP片段用限制性核酸内切酶HaeIII5U水浴锅中酶切6-14h，PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：代丽萍，谢伟，张有改，段富交，李记天，王凯娟，宋春花，张建营，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41