测定人CDKN1B基因rs34329位点多态性的方法及试剂盒技术

测定人CDKN1B基因rs34329位点多态性的方法及试剂盒。该方法包括：提供待测人基因组DNA；提供扩增人CDKN1B基因rs34329位点附近序列的上游引物和下游引物，其中下游引物具有错配碱基G；以所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应以获得含SATTC片段的扩增产物，或含AGSATTC的扩增产物，其中S为人CDKN1B基因rs34329位点上的待定碱基C或G；提供限制性内切酶；利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切以获得相应的酶切产物；以及根据所得酶切产物来确定人CDKN1B基因rs34329位点上的待定碱基S是C还是G。限制性内切酶为仅能够切开GATTC片段与CATTC片段之一的限制性内切酶，或为仅能够切开AGCATTC或AGGATTC片段之一的限制性内切酶。该测定手段不但快速可靠，而且测定成本大大降低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及测定单核苷酸多态性的方法。
技术介绍
SNP(单核苷酸多态性)是指单个核苷酸的改变引起的DNA序列变异，包括单碱基的置换、插入和缺失等形式。基因多态性是个体与生俱来的遗传特征，不随环境发生变化，也不是某种疾病特异或者非特异的临床表现，因此其应用并不存在诊断和治疗作用。基因多态性检测在遗传学领域和医学领域中应用广泛，举例如下：1.研究物种起源和进化等遗传学现象。根据基因变异情况，获得生物大分子的信息，推断生物进化历史，阐明物种进化关系。应用于考古学中以确定古人类遗传变异特征以及不同种群的亲缘关系。2.研究多态与种群亲缘关系等遗传学研究。多态亦与各种人体特征密切相关，包括身高、体重、肤色、相貌特征等等。3.在预防医学领域可以用于疾病预防措施。通过研究人体对毒物的耐受性，发现易于对某种毒物发生毒性作用的个体，及时避免该个体与毒物接触，保护该易感人群。例如，对准备从事接触苯等有机溶剂的人群进行多态检测，筛查出容易出现血液毒性、神经毒性等反应的个体，令其远离苯等有机溶剂，保护此类易感人群免受毒物侵害。4.药理学中可以用于药物选择以及剂量确定。通过多态检测可以判断患病个体对某种药物毒副作用敏感，从而避免使用此种药物以免除其毒性作用。通过判断个体对药物效果的反应程度确定药物剂量，减少药物用量及其副作用。细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂1B基因(cyclin-dependentkinaseinhibitor1B,CDKN1B)又称p27基因，是近年来发现的一种重要的细胞周期调控基因，该基因是一种抑癌基因，定位于12号染色体短臂上，主要生物学功能是阻止细胞分裂时由G1期向S期转变，诱导细胞凋亡等。CDKN1B基因rs34329位点位于内含子区域，有研究表明该多态可能影响CDKN1B的功能。CDKN1B基因rs34329位点多态，在人群中存在两种等位基因G和C，形成三种CDKN1B基因的基因型：GG型(人体基因组rs34329多态位点的两个等位基因碱基均为G)，CG型(人体基因组rs34329多态位点的两个等位基因碱基分别为C和G)和CC型(人体基因组rs34329多态位点的两个等位基因碱基均为C)。聚合酶链式反应-限制性片断长度多态(PCR—RFLP)技术是一种快速、简便、准确、低成本测定SNP(单核苷酸多态性)基因型的经典方法。该方法通过引物来对模板进行扩增反应，形成足够数量和稳定的扩增产物，通过对扩增产物的酶切和检测酶切产物的片段长度，最终测定出SNP。CDKN1B基因rs34329多态位点采取PCR—RFLP技术进行检测，所需内切酶为MwoI，其价格较昂贵，因此需要开发新的检测技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种非疾病诊断或治疗目的用的测定人CDKN1B基因rs34329位点多态性的可靠手段。根据本专利技术的第一方面，提供了一种测定人CDKN1B基因rs34329位点多态性的方法，包括：提供待测人基因组DNA；提供扩增人CDKN1B基因rs34329位点附近序列的上游引物和下游引物，其中下游引物具有错配碱基G；以所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应以获得含SATTC片段或AGSATTC片段的扩增产物，其中S为人CDKN1B基因rs34329位点上的待定碱基C或G；提供限制性内切酶；利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切(反应)以获得相应的酶切产物；以及根据所得酶切产物来确定人CDKN1B基因rs34329位点上的待定碱基S是C还是G，其中，限制性内切酶为仅能够切开CATTC片段与GATTC片段之一的限制性内切酶，或为仅能够切开AGCATTC或AGGATTC片段之一的限制性内切酶。根据本专利技术的实施例，在所得扩增产物上，下游引物的错配碱基G与多态位点S的互补碱基之间相隔三个碱基AAT。令人惊讶的是，如此设置错配碱基将使酶切反应进行得极其顺利，不会出现酶切不充分等现象。并且，如此设置上游引物错配碱基使PCR反应进行顺利，提高了PCR的灵敏度和特异度，这可能与错配碱基后使得扩增序列的二级结构改变有关。在本专利技术的一个可选实施例中，在所得扩增产物上，下游引物末端碱基与多态位点S的互补碱基相邻。在本专利技术的一个优选实施例中，在所得扩增产物上，下游引物末端碱基不与多态位点S的互补碱基相邻。例如，下游引物末端可以是……GAA、……GA等结构。难以想象，具有这种设计的上游引物竟然会进一步大大促进酶切反应，这可能与扩增结合力有某种关联。在本专利技术的一个优选实施例中，限制性内切酶可以采用仅能切开GANTC片段的HinfI或其同裂酶。这类HinfI酶价格低廉，能大大降低测定成本。根据本专利技术的实施例，所得酶切产物包括三种片段类型：具有总片段长度的未切断扩增产物、切断后具有较长片段的扩增产物以及切断后具有较短片段的扩增产物(较短片段通常不能有效观测到)。通过观测(判断)酶切产物所包含的片段类型来确定人CDKN1B基因rs34329位点上的待定碱基是C还是G。例如，在采用HinfI酶的情况下，根据总片段和切断后较长片段这两个片段的观察结果来进行判断：如果观察到酶切产物只有一种具有总片段长度的未切断扩增产物，则待定碱基为C；如果观察到酶切产物只有一种具有较长片段(小于总片段长度)的切断产物，则待定碱基为G；如果观察到上述二者，则待定碱基既包括C又包括G。在本专利技术的一个实施例中，判断(或观测)酶切产物所包含的片段类型是通过凝胶电泳联合紫外灯拍照后与参照图对比来进行的。这种情况下，优选参照图是扩增产物在凝胶电泳标准设定时间后经紫外灯拍照后而得且仅具有第一参照图像位置和第二参照图像位置，其中第一参照图像位置针对的是未切断的总片段长度的扩增产物，而第二参照图像位置则针对的是切断后具有较长片段的扩增产物。例如，本专利技术采用的参照图是由合成的118bp和81bp两个碱基片段同时经凝胶电泳相同时间后紫外灯拍照而成。与常规DNAladder的复合参照图相比，由于采用了仅具有两个特定参照图像位置的参照图，本发明的这种方法能够直观快速地观测或判断酶切产物所包含的片段类型，同时最大限度地避免了误判。酶切反应后优选将酶切产物浓缩1～2倍浓度后进行电泳，增加图像亮度，提高判断准确性。在本专利技术的优选实施例中，通过设计上游引物和下游引物的长度而使得扩增产物的总片段长度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定人CDKN1B基因rs34329位点多态性的方法，包括：提供待测人基因组DNA；提供扩增人CDKN1B基因rs34329位点附近序列的上游引物和下游引物，其中下游引物具有错配碱基G；以所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应以获得含SATTC片段或AGSATTC片段的扩增产物，其中S为人CDKN1B基因rs34329位点上的待定碱基C或G；提供限制性内切酶；利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切以获得相应的酶切产物；以及根据所得酶切产物来确定人CDKN1B基因rs34329位点上的待定碱基S是C还是G，其中，限制性内切酶为仅能够切开CATTC片段与GATTC片段之一的限制性内切酶，或为仅能够切开AGCATTC或AGGATTC片段之一的限制性内切酶。

【技术特征摘要】
1.一种测定人CDKN1B基因rs34329位点多态性的方法，包括：
提供待测人基因组DNA；
提供扩增人CDKN1B基因rs34329位点附近序列的上游引物和下
游引物，其中下游引物具有错配碱基G；
以所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行
PCR扩增反应以获得含SATTC片段或AGSATTC片段的扩增产物，其中
S为人CDKN1B基因rs34329位点上的待定碱基C或G；
提供限制性内切酶；
利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切以获得相应的酶切
产物；以及
根据所得酶切产物来确定人CDKN1B基因rs34329位点上的待定
碱基S是C还是G，
其中，限制性内切酶为仅能够切开CATTC片段与GATTC片段之一
的限制性内切酶，或为仅能够切开AGCATTC或AGGATTC片段之一的限
制性内切酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在所得扩增产物上，下游
引物的错配碱基G与多态位点S的互补碱基之间相隔三个碱基AAT。
3.根据权利要求2所述的方法，其中在所得扩增产物上，下游
引物末端碱基与多态位点S的互补碱基相邻或不相邻。
4.根据权利要求1所述的方法，其中限制性内切酶为仅能切开
GATTC片段的HinfI、TfiI或其同裂酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其中限制性内切酶为能切开
AGCATTC片段的BsmI或其同裂酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所得酶切产物包括三种片
段类型：具有总...

【专利技术属性】
技术研发人员：王威，王思华，燕贞，李春阳，姚武，王彭彭，王团伟，段晓冉，冯晓蕾，吴逸明，杨永利，施学忠，黄陕南，张逾梦，黄福生，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41