根据TCGA、NCCN、FDA等的癌症基因组及药物数据，筛选入组基因165个。其中包含NCCN推荐检测基因、FDA已批准靶药和重要临床期药物相应靶基因、影响靶药用药效果的基因、影响化药敏感性及毒副作用的基因等。本发明专利技术通过探针捕获技术一次性富集165个基因的外显子区域，实现多基因多靶点并行深度高通量测序，可同时检测基因的多种变异类型(如点突变，缺失，插入，融合，拷贝数扩增)，在检测的深度和准确度上均优于现有的技术。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和生物技术检测领域，具体涉及一种用于165基因靶区域富集方法，用于循环肿瘤DNA(ctDNA)多靶点并行深度高通量测序，且同时检查基因的多种变异类型，如突变，缺失，插入，融合，拷贝数扩增，在检测的深度和广度上均优于现有的技术。
技术介绍
循环DNA是一种无细胞状态的胞外DNA，存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中，其主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在。循环DNA作为一种新的肿瘤标志物，将在肿瘤的诊断、治疗及预后检测等方面发挥重要作用，尤其对于一些不具有典型临床症状、检查无特异性和诊断困难的肿瘤可避免复杂的、具有创伤性的活检。循环肿瘤DNA(ctDNA)，是指肿瘤细胞体细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统，随着基因测序的飞速发展，目前，已能在血液中对其进行检测并计数。ctDNA来自肿瘤细胞的体细胞突变，不同于遗传突变的是其存在于体内每个细胞。因此，ctDNA是一种特征性的肿瘤生物标记物，并且还可以被定性、定量和追踪。与组织活检相比ctDNA检查微创小、无放射性污染、经济、新DNA无防腐剂污染等优点，并允许对治疗反应实时监测。针对ctDNA的检测有数字PCR、BEAMing技术、标记扩增深度测序(TAM-Seq)、癌症个体化深度测序(CAPP-Seq)，但这些方法是对已知突变的检测，已知突变的信息获得麻烦，并且检测范围有限。除此外还有全基因组测序、全外显子测序，这些方法不需要已知突变信息，但是成本昂贵。根据TCGA、NCCN、FDA等的癌症基因组及药物数据，筛选入组基因165个。其中包含NCCN推荐检测基因、FDA已批准靶药和重要临床期药物相应靶基因、影响靶药用药效果的基因、影响化药敏感性及毒副作用的基因等。本专利技术通过探针捕获技术一次性富集165个基因的外显子区域，实现多基因多靶点并行深度高通量测序，可同时检测基因的多种变异类型(如点突变，缺失，插入，融合，拷贝数扩增)，在检测的深度和准确度上均优于现有的技术。
技术实现思路
165基因靶区域的富集及建库提取5个不同样本血浆中的游离DNA，将DNA定量后分别溶解在50ulddH2O中，进行文库构建。1.准备末端修复所需试剂，10×KAPAEndRepairBuffer，KAPAEndRepairEnzymeMix置于冰上溶解，5个样本DNA分别按照以下体系进行末端修复。将混合液上下吹打混匀后，置于20℃孵育30min。2.AMPureXP磁珠纯化2.1.让AMPureXPbead在室温放置至少30min，充分混匀AMPureXPbead悬浮液；2.2.在1.5ml新管中加入1.7倍体积混匀的AMPureXPbeads悬浮液和修复后的5个DNA样品，吹吸混匀10次以上，室温放置5min；2.3.短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；2.4.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；2.5.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul80％乙醇，放置30s，弃乙醇；2.6.重复步骤5；2.7.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量3.连接A尾。将上述磁珠分别溶解在50ulA尾连接体系中，体系如下PCR级ddH2O42ul10×KAPAA-TailingBuffer5ulKAPAA-TailingEnzyme3ul将混合液上下吹打混匀后，置于30℃孵育30min。4.纯化A尾连接产物4.1向50ul连接产物中加入90ul融解的室温下的PEG/NaClSPRI溶液，混匀混合物后室温静置15min以结合磁珠4.2短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；4.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；4.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul80％乙醇，放置30s，弃乙醇；4.5.重复步骤4.4；4.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量5.样本DNA连接接头将上述磁珠分别溶解在47ul连接接头的体系中，体系如下PCR级水32ul5×KAPALigationBuffer10ulKAPAT4DNALigase5ul将体系混匀后，每个样本中加入3ul含有不同Index的接头。上下吹混数次后，置于20℃孵育15min。6.纯化接头连接产物6.1向50ul连接产物中加入50ul融解的室温下的PEG/NaClSPRI溶液，混匀混合物后室温静置15min以结合磁珠.6.2短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；6.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；6.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul80％乙醇，放置30s，弃乙醇；6.5.重复步骤5；6.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量6.7加入22ulddH2O溶解DNA，混匀后室温5min，充分溶解，置于磁力架上静置2min，吸取22ul上清。7.捕获前扩增扩增前将引物用ddH2O溶解，并将Pre-CaptureLM-PCRMasterMix置于冰上溶解，配置如下反应体系KAPAHiFiHotStartReadyMix(2x)25ulPreLM-PCROligos1&2,5μM*5ul文库DNA20将上述混合液混匀并置于PCR仪中，执行如下程序反应结束后得到的即是捕获前PCR样本。8.纯化捕获前前PCR产物8.1.在1.5ml新管中加入1.4倍体积混匀的AMPureXPbeads悬浮液和5个PCR产物，吹吸混匀10次以上，室温放置5min；8.2.短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；8.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；8.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul80％乙醇，放置30s，弃乙醇；8.5.重复步骤5；8.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量8.7.在磁力架上取下离心管加入52ulddH2O，充分溶解DNA，室温下静置5min后，置于磁力架上，吸取50ul上清于新的离心管中。9.文库杂交9.1杂交前的准备，分别溶解SeqCapHEUniversalOligo和SeqCapHEIndexOligo至终浓度为1000uM置于-20℃.9.2准备杂交混合样本，将5个不同Index的样本定量，并且相同比例混合至1.25ug。9.3准备提高混合杂交的引物池，在冰上溶解1000uM的SeqCapHEUniversalOligo和SeqCapHEIndexOligo，混合比例为50％的SeqCapHEUniversalOligo和50％的SeqCapHEIndexOligos，总引物量为2000pmol，具体实施如下表组分含量9.4准备杂交样本9.4.1取5ulCOTHumanDNA(1mg/ml)加入1.5ml离心管中9.4.2将1.25ug的混合文库加入到9.4.1的离心管中9.4.3将2000pmol的混合引物SeqCapHEUniversalOligo和SeqCapHEIndexO本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于165基因靶区域富集方法，其特征在于，包括如下步骤：提取5个不同样本血浆中的游离DNA，将DNA定量后分别溶解在50ul ddH2O中，进行文库构建。提取5个不同样本血浆中的游离DNA，将DNA定量后分别溶解在50ul ddH2O中，进行文库构建。1.1准备末端修复所需试剂，10×KAPA End Repair Buffer，KAPA End Repair Enzyme Mix置于冰上溶解，5个样本DNA分别按照以下体系进行末端修复。将混合液上下吹打混匀后，置于20℃孵育30min。AMPure XP磁珠纯化2.1.让AMPure XP bead在室温放置至少30min，充分混匀AMPure XP bead悬浮液；2.2.在1.5ml新管中加入1.7倍体积混匀的AMPure XP beads悬浮液和修复后的5个DNA样品，吹吸混匀10次以上，室温放置5min；2.3.短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3‑5min至溶液变澄清；2.4.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；2.5.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；2.6.重复步骤5；2.7.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量。连接A尾。3.1将上述磁珠分别溶解在50ul A尾连接体系中，体系如下PCR级ddH2O 42ul10×KAPA A‑Tailing Buffer 5ulKAPA A‑Tailing Enzyme 3ul将混合液上下吹打混匀后，置于30℃孵育30min。纯化A尾连接产物4.1向50ul连接产物中加入90ul融解的室温下的PEG/NaCl SPRI溶液，混匀混合物后室温静置15min以结合磁珠4.2短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3‑5min至溶液变澄清；4.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；4.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；4.5.重复步骤4.4；4.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量样本DNA连接接头5.1将上述磁珠分别溶解在47ul连接接头的体系中，体系如下PCR级水 32ul5×KAPA Ligation Buffer 10ulKAPA T4DNA Ligase 5ul5.2将体系混匀后，每个样本中加入3ul含有不同Index的接头。上下吹混数次后，置于20℃孵育15min。纯化接头连接产物6.1向50ul连接产物中加入50ul融解的室温下的PEG/NaCl SPRI溶液，混匀混合物后室温静置15min以结合磁珠.6.2短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3‑5min至溶液变澄清；6.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；6.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；6.5.重复步骤5；6.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量6.7加入22ul ddH2O溶解DNA，混匀后室温5min，充分溶解，置于磁力架上静置2min，吸取22ul上清。捕获前扩增7.1扩增前将引物用ddH2O溶解，并将Pre‑Capture LM‑PCR Master Mix置于冰上溶解，配置如下反应体系KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2x) 25ulPre LM‑PCR Oligos 1&2,5μM* 5ul文库DNA 20将上述混合液混匀并置于PCR仪中，执行如下程序反应结束后得到的即是捕获前PCR样本。纯化捕获前前PCR产物8.1.在1.5ml新管中加入1.4倍体积混匀的AMPure XP beads悬浮液和5个PCR产物，吹吸混匀10次以上，室温放置5min；8.2.短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3‑5min至溶液变澄清；8.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；8.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；8.5.重复步骤5；8.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量8.7.在磁力架上取下离心管加入52ul ddH2O，充分溶解DNA，室温下静置5min后，置于磁力架上，吸取50ul上清于新的离心管中。文库杂交9.1杂交前的准备，分别溶解SeqCap HE Universal Olig...
【技术特征摘要】
1.一种用于165基因靶区域富集方法，其特征在于，包括如下步骤：提取5个不同样本血浆中的游离DNA，将DNA定量后分别溶解在50ulddH2O中，进行文库构建。提取5个不同样本血浆中的游离DNA，将DNA定量后分别溶解在50ulddH2O中，进行文库构建。1.1准备末端修复所需试剂，10×KAPAEndRepairBuffer，KAPAEndRepairEnzymeMix置于冰上溶解，5个样本DNA分别按照以下体系进行末端修复。将混合液上下吹打混匀后，置于20℃孵育30min。AMPureXP磁珠纯化2.1.让AMPureXPbead在室温放置至少30min，充分混匀AMPureXPbead悬浮液；2.2.在1.5ml新管中加入1.7倍体积混匀的AMPureXPbeads悬浮液和修复后的5个DNA样品，吹吸混匀10次以上，室温放置5min；2.3.短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；2.4.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；2.5.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul80％乙醇，放置30s，弃乙醇；2.6.重复步骤5；2.7.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量。连接A尾。3.1将上述磁珠分别溶解在50ulA尾连接体系中，体系如下PCR级ddH2O42ul10×KAPAA-TailingBuffer5ulKAPAA-TailingEnzyme3ul将混合液上下吹打混匀后，置于30℃孵育30min。纯化A尾连接产物4.1向50ul连接产物中加入90ul融解的室温下的PEG/NaClSPRI溶液，混匀混合物后室温静置15min以结合磁珠4.2短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；4.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；4.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul80％乙醇，放置30s，弃乙醇；4.5.重复步骤4.4；4.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量样本DNA连接接头5.1将上述磁珠分别溶解在47ul连接接头的体系中，体系如下PCR级水32ul5×KAPALigationBuffer10ulKAPAT4DNALigase5ul5.2将体系混匀后，每个样本中加入3ul含有不同Index的接头。上下吹混数次后，置于20℃孵育15min。纯化接头连接产物6.1向50ul连接产物中加入50ul融解的室温下的PEG/NaClSPRI溶液，混匀混合物后室温静置15min以结合磁珠.6.2短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；6.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；6.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul80％乙醇，放置30s，弃乙醇；6.5.重复步骤5；6.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量6.7加入22ulddH2O溶解DNA，混匀后室温5min，充分溶解，置于磁力架上静置2min，吸取22ul上清。捕获前扩增7.1扩增前将引物用ddH2O溶解，并将Pre-CaptureLM-PCRMasterMix置于冰上溶解，配置如下反应体系KAPAHiFiHotStartReadyMix(2x)25ulPreLM-PCROligos1&2,5μM*5ul文库DNA20将上述混合液混匀并置于PCR仪中，执行如下程序反应结束后得到的即是捕获前PCR样本。纯化捕获前前PCR产物8.1.在1.5ml新管中加入1.4倍体积混匀的AMPureXPbeads悬浮液和5个PCR产物，吹吸混匀10次以上，室温放置5min；8.2.短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；8.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；8.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul80％乙醇，放置30s，弃乙醇；8.5.重复步骤5；8.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量8.7.在磁力架上取下离心管加入52ulddH2O，充分溶解DNA，室温下静置5min后，置于磁力架上，吸取50ul上清于新的离心管中。文库杂交9.1杂交前的准备，分别溶解SeqCapHEUniversalOligo和SeqCapHEIndexOligo至终浓度为10...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘鹏飞，张文会，朱东兴，韩雪，
申请(专利权)人：刘鹏飞，
类型：发明
国别省市：天津;12
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