一种抗DDX5的全人源单克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种全人源的抗DDX5的单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明专利技术还公开了编码所述抗体的完整基因及氨基酸序列。本发明专利技术从全人源抗体杂交瘤细胞库中筛选出抗DDX5的单克隆抗体，通过大规模培养收集细胞培养上清，经过亲和柱纯化获得。然后通过对抗体基因测序获得该抗体cDNA序列，并克隆到真核表达载体中，通过宿主细胞表达系统大规模培养，经过亲和柱纯化获得该抗体。本发明专利技术得到的抗DDX5全人源抗体对DDX5具有良好的亲和力，并能够抑制DDX5在细胞核内的功能，因此可用于DDX5相关的肿瘤、感染性疾病、免疫系统疾病的诊断和治疗。

Human complete monoclonal antibody against DDX5, preparation method and application thereof

The invention discloses a whole human source anti DDX5 monoclonal antibody, a preparation method and an application thereof. The present invention also discloses the complete gene and amino acid sequence encoding the antibody. In the invention, monoclonal antibodies against DDX5 are screened from the whole human source antibody hybridoma cell library, and the supernatant of the cell culture is collected by large-scale culture and purified by affinity column. The antibody cDNA sequence was then sequenced and cloned into the eukaryotic expression vector. The antibody was purified by affinity column after large scale culture by host cell expression system. The invention has the anti DDX5 human antibody has good affinity to DDX5, and can inhibit DDX5 in the nucleus, so it can be used to DDX5 related tumor, diagnosis and treatment of infectious diseases and diseases of the immune system.

【技术实现步骤摘要】
一种抗DDX5的全人源单克隆抗体及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种全人源单克隆抗体及其制备方法和应用，特别涉及一种抗DDX5的全人源单克隆抗体及其制备方法和在检测DDX5表达以及预防或治疗DDX5相关的疾病中的用途，本专利技术属于医药

技术介绍
DDX5(DEAD-BoxHelicase5)隶属于DEADbox家族，又称为p68，是一种ATP依赖的RNA解旋酶，最初被认为是一种参与细胞生长和分化的核蛋白。RNA解旋酶(RNAhelicases)是一个包含了与RNA代谢(翻译起始、核糖体形成、前mRNA拼接和mRNA降解)许多方面有关的蛋白质家族。RNA解旋酶是由水解ATP供给能量来解开RNA的酶。它们常常依赖于单链的存在，并能识别复制单链结构。一般在RNA复制过程中起到催化双链RNA解旋的作用。DDX5同时具有依赖于RNA的ATPase活性，它与SV40大T抗原有交叉免疫反应。DDX5在RNA代谢的各个方面发挥重要作用，参与mRNA前体加工、RNA反转、RNA转运、核糖体的合成和翻译以及RNA降解等过程。同时DDX5转录后的磷酸化也参与了肿瘤的发生和细胞的增殖和转化。例如，蛋白的SUMO(sumoylation)修饰可以直接影响DDX5的蛋白稳定性及转录功能。DDX5与HDAC1结合能够抑制转录，这种转录抑制的过程能够被SUMO修饰所调节。DDX5还能与Runx2,p53,Smad3,CBP以及p300相互作用。已有研究表明，DDX5在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、急性髓性白血病等多种肿瘤细胞中高表达，抑制DDX5的表达能够抑制这些种类肿瘤细胞的增殖。DDX5在调控丙型肝炎病毒复制过程中亦发挥一定作用，说明DDX5的监测和调控在实现肿瘤和感染性疾病的精准诊断和治疗中具有重要价值。目前全人源单克隆抗体是治疗性抗体发展的主要方向，本专利技术通过人源杂交瘤技术获得了全人源抗体克隆库，为抗体的制备筛选提供了良好的技术平台，筛选出来的抗体为人体内自然产生的抗体，避免了人源化过程引入的人为加工因素，更符合人体内的自然生理过程，具有广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗DDX5的全人源单克隆抗体及其制备方法和应用。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：(1)抗DDX5单克隆抗体的初步筛选，通过ELISA技术对全人源杂交瘤抗体库中的抗体进行筛选，获得了一种亲和力较高的抗体。(2)扩大培养筛选到的人源杂交瘤细胞株，亲和层析纯化单克隆抗体，通过免疫印迹技术，检测筛选到的抗体与DDX5纯化蛋白之间的亲和力；(3)对筛选到的杂交瘤细胞进行抗体全基因测序，构建抗体DNA重组表达质粒。(4)抗体DNA重组表达质粒转染宿主细胞，表达并纯化单克隆抗体，进行亲和力鉴定和比较。(5)将上述(2)、(4)中获得的单克隆抗体与肿瘤细胞作用进行生物学功能鉴定和比较。在上述研究的基础上，本专利技术筛选得到一株能够特异性结合DDX5的全人源单克隆抗体，其由轻链和重链组成，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.6所示，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.8所示。其中，轻链1G3-L1的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示；LCDR1序列为QSVSSN，LCDR2序列为GAS，LCDR3序列为QQYNNWPRT。其中，重链1G3-H1的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示；HCDR1序列为GFTFSDYS，HCDR2序列为ITSSSGYT，HCDR3序列为ARVRSSWGPIDS。在本专利技术中，优选的，所述的特异性结合DDX5的全人源单克隆抗体中，轻链的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，所述重链的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。本领域技术人员将知晓的是，抗体中的保守性氨基酸替换并不会实质性地影响抗体的亲和力和结构，尤其是所述保守性替换发生在恒定区时。因此，若氨基酸的变化发生在恒定区且变化后并不影响抗体的生物学活性，那么该抗体也应在本专利技术的保护范围之内。进一步的，本专利技术还提出了包含所述全人源单克隆抗体的单个重链和/或单个轻链的单域抗体、嵌合抗体、抗体融合蛋白抗体、抗体/抗体片段-因子融合蛋白或抗体/抗体片段-化学偶联物。以及所述的全人源单克隆抗体的抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段可选自Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd'片段。再进一步的，本专利技术还提出了一种分离的DNA分子，其为编码所述的抗体或所述的抗原结合片段的核苷酸序列，优选的，所述的核苷酸序列包含SEQIDNO:5和/或SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，更优选的，所述的核苷酸序列包含SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。含有所述的核苷酸序列或其组合的重组DNA表达载体以及含有所述的核苷酸序列或所述的重组DNA表达载体的宿主细胞也在本专利技术的保护范围之内，优选的，所述的宿主细胞选自原核细胞、酵母或哺乳动物细胞，更优选的，所述宿主细胞选自HEK293F细胞、CHO细胞或NSO细胞。所述HEK293F细胞为人胚肾293F细胞(humanembryonickidney293Fcell)；CHO细胞为中国仓鼠卵巢细胞(chinesehamsterovarycell)；NSO细胞为小鼠NSO胸腺瘤细胞(mousethymomaNSOcells)。更进一步的，本专利技术还提出了所述的抗体、所述的抗原结合片段、所述的核苷酸序列、所述的载体以及所述的宿主细胞在制备用于预防或治疗与DDX5相关的肿瘤、感染性疾病或免疫系统疾病，其中，优选的，所述肿瘤包括但不限于胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴癌、黑色素瘤、急性或慢性白血病、肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌、头颈癌、结直肠癌、实体瘤；所述感染性疾病包括不限于HIV病毒感染、A型，B型或C型肝炎病毒感染、疱疹病毒感染、流感病毒感染；所述免疫系统疾病包括不限于系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、重症肌无力、多发性硬化症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、硬皮病、结节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病。以及所述的抗体、所述的抗原结合片段、所述的核苷酸序列、所述的载体以及所述的宿主细胞在制备DDX5检测试剂中的应用。更进一步的，本专利技术还提出了制备所述特异性结合DDX5的全人源单克隆抗体的方法，包括如下步骤：(1)提供表达载体，所述表达载体含有编码所述抗体或所述抗原结合片段的DNA分子，以及与所述DNA分子可操作相连的表达调控序列；(2)用所述表达载体转化宿主细胞；(3)在适合表达所述抗体的条件下，培养含有所述表达载体的宿主细胞；(4)分离纯化获得所述的单克隆抗体；其中，优选的，所述的表达载体为含有抗体分泌信号肽序列的真核表达载体pcDNA3.4，所述的宿主细胞为HEK293F细胞。本专利技术提供的单克隆抗体可以通过消除、抑制DDX5活性来预防、诊断和治疗疾病，本专利技术提供的抗DDX5蛋白单克隆抗体是全人源的，与其它动物源性(如鼠源性)的抗DDX5抗体相比，因物种差异导致的免疫原性大大减少，且特异性好、亲和力高，如本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性结合DDX5的全人源单克隆抗体，由轻链和重链组成，其特征在于所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示。

【技术特征摘要】
1.一种特异性结合DDX5的全人源单克隆抗体，由轻链和重链组成，其特征在于所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.6所示，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.8所示。2.如权利要求1所述的特异性结合DDX5的全人源单克隆抗体，其特征在于所述轻链的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，所述重链的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。3.包含权利要求1或2所述全人源单克隆抗体的单个重链和/或单个轻链的单域抗体、嵌合抗体、抗体融合蛋白抗体、抗体/抗体片段-因子融合蛋白或抗体/抗体片段-化学偶联物。4.权利要求1或2所述的全人源单克隆抗体的抗原结合片段，其特征在于所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd'片段。5.一种分离的DNA分子，其特征在于所述DNA分子为编码权利要求1-3任一项所述的抗体或权利要求4所述的抗原结合片段的核苷酸序列，优选的，所述的核苷酸序列包含SEQIDNO:5和/或SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，更优选的，所述的核苷酸序列包含SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。6.含有权利要求5所述的核苷酸序列或其组合的重组DNA表达载体。7.含有权利要求5所述的核苷酸序列或权利要求6所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，优选的，所述的宿主细胞选自原核细胞、酵母或哺乳动物细胞，更优选的，所述宿主细胞选自HEK293F细胞、CHO细胞或NSO细胞。8.权利要求1-3任一项所述的抗体、权利要求4所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张凤民，宋武琦，吴静，考文萍，李玉军，郭彩玲，翟爱霞，孙迪，潘超，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23