通过聚合的DNA测序方法技术

本发明专利技术涉及通过物理操作测定核酸序列的方法。本方法基于通过测量分子的一端和复制叉之间的物理距离来精确确定复制叉在模板上的位置。这允许确定发生复制暂停或阻断的位点的物理位置，并由此推导核酸的序列信息。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过物理操作测定核酸序列的方法。尤其是，所述方法包括步骤:确定发生复制暂停的位点的物理位置，并由此推导核酸的序列信息。根据本专利技术的方法基于物理技术和电子处理，不同于当前的化学的或生化的方法。它的优点是多方面的:1)它允许单个分子的测序，从而不需要在先的扩增步骤(例如，通过PCR)。2)它远比本领域的方法便宜，由于标准核酸分子的使用，其远不及标记的核苷酸(有荧光团或一些其它基团)昂贵。3)它使得通过测量所述双链核酸分子两端之间的距离来确定新和成的互补链沿着双链核酸的定位(以bp为单位)成为可能。4)在一个实施方式中，其允许在一个聚合运行中测定给定核苷酸沿着链的位置。5)该测量可以在另一个时间尺度上周期性地重复，从而导致假阳性(聚合酶的伪滞留)的消除、改进的统计学以及仪器漂移的显著降低。 6)在同一分子上可以多次重复该实验，由于可以在复制步骤之后驱除(eject)新和成的单链核酸(例如，通过降低力或离子强度，或通过使用解旋酶或外切核酸酶活性)，从而改进了测量统计学和可靠性。它允许不同的双链核酸分子的平行测序，因为每个分子可以独立于其它分子而进行操纵。7)未经修饰的酶可用于合成新链，与第三代单分子测序相比，其降低了相关成本并改善出错率，第三代单分子测序在聚合酶中引入位点特异性突变来切割染料接头、或将酶结合至一侧、或用量子点对酶进行修饰。本专利技术涉及基于复制暂停或阻断的位点在测序的核酸分子上的物理位置测定核酸序列的方法。“核酸序列的测定”此处不仅表示破译核酸中碱基的实际连续，也表示直接或间接导致核酸序列上一些信息的获得的所有活动，比如检测核酸分子中的特定序列，或检测两个不同核酸分子序列之间的差异。用于测定核酸序列的大多数方法依赖于由持续性聚合酶所引发的新链合成。在这些方法中，引物杂交至双链核酸模板的一条链上；新链利用聚合酶从引物合成；合成在特定的位点暂停或阻断；并检测聚合中的这些暂停或阻断从而给出所述核酸序列方面的信肩、O根据本专利技术，现已发现，有可能探索与阻断相关的物理参数来获得双链核酸的序列信息。更精确地，本专利技术人已经发现有可能在所述双链核酸分子上物理定位发生复制暂停或阻断的位点；然后，暂停或阻断的特异性物理位置提供所述双链核酸的序列信息。本专利技术源自这样的观察，即当部分变性的双链核酸分子处于张力之下时，有可能测量所述分子两个末端之间的物理距离。在通过合成进行测序的过程中，复制叉的前进和双链核酸分子的解旋有关，在后面留下两个游离端，其在复制叉处结合。当复制在特定位点阻断时，双链核酸分子以这样的构象被阻断，其中复制叉前面的两条链仍是退火的，而复制叉之后的两条母链是分开的。本专利技术人现已发现，当所述双链核酸分子处于张力之下时，有可能测量所述双链核酸分子两个分开的末端之间的物理距离。然后，可以根据所述距离推导在所述双链核酸分子上发生复制暂停或阻断的位点的物理位置，从而获得关于所述双链核酸分子的序列的一些信息。因此，本专利技术涉及用于测定核酸序列的方法，所述方法包括步骤:a)使对应于所述核酸序列的双链核酸分子变性；b)单链核酸分子(“引物”)和所述变性的双链核酸分子杂交；c)向b)中获得的 杂交的引物/双链核酸分子施加张力；d)将步骤b)中获得的杂交的引物/双链核酸分子与聚合酶在导致复制中至少一个暂停的条件下进行孵育；以及e)确定所述暂停在复制中相对于双链核酸一端的位置。“变性”在此处表示所述链之间的大部分氢键断裂时发生的双链核酸分子的链分离的过程。变性过程产生变性的核酸分子，其在此处表示双链核酸分子变性所产生的两条分离的互补链。“复性”在此处涉及这样的过程，通过这种过程两条分离的互补链通过杂交重新形成双螺旋。如此处所用，“杂交”是核酸的两条或两条以上互补链之间建立非共价的、序列特异性的相互作用从而形成单个杂交体的过程。有本领域技术人员已知的变性核酸的几种可能。在一个最优选的方式中，通过向它们施加物理力将两条链分开。例如，所述双链核酸的游离端可被拉开，从而断裂配对碱基之间的所有键并打开双链核酸。在这种类型的序列测定方法中，为了促进重新配对，安排双链DNA的游离端(即没有附着至支持物的端)在被拉开之前共价或准共价连接至另一端是有利的。在一个优选的实施方案中，双链核酸分子是发夹。在另一个优选实施方式中，一条链的5’端直接共价结合至另一条链的3’端。如果想要双链核酸示意性表示在本专利技术的上下文中，可以将其比作“拉链”(zip fastener),其打开(或关闭):双链核酸的变性就是拉开拉链,复性是重新拉上拉链。本专利技术的单链核酸尤其可以是DNA或RNA分子，天然的或修饰的。如此处所用，术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”表示由脱氧核糖核苷酸组成的聚合物。如此处所用，术语“核糖核酸”和“RNA”表示由核糖核苷酸组成的聚合物。所述单链核酸也可以由修饰的核苷酸构成，如锁核酸(LNA)，其是其中核糖部分修饰有连接2’氧和4’碳的额外桥的核苷酸，或者肽核酸(PNA)，其中主链由通过肽键连接的重复的N- (2-氨乙基)-甘氨酸单元组成。本专利技术适用于任何类型的双链核酸。大多数情况下，双链核酸将是DNA，但应当理解，本专利技术也适用于完全配对的或者不完全配对的单链DNA-单链DNA双链体，或适用于完全配对的或者不完全配对的单链DNA-单链RNA双链体，或适用于完全配对的或者不完全配对的单链RNA-单链RNA双链体。此外，双链体可能由获自不同来源的样本的两条单链的至少部分重新配对组成。最后，本专利技术也适用于唯一单链DNA或唯一单链RNA的二级结构。在典型的结构中，双链核酸分子可以特异性地锚定在两种固体基质上(如显微镜载玻片、微量吸移器、微粒)。末端之一可直接或间接地连接到表面上，而另一端直接或间接连接到一个可移动的表面。在本实施方式中，当支持物移开时，在双链核酸的两端施加了张力。当张力高于阈值时，两条链分离并且核酸分子被变性。施加的张力优选高于或等于15pN ;更优选高于或等于16pN ;甚至更优选高于或等于17pN ;在非常优选的方面，它高于或等于18pN。这种力可随温度、核苷酸类型和缓冲液而变化，但本领域技术人员根据这些参数将很容易调整所述力，以获得两条链的分离。在本专利技术的一个优选实施方式中，通过施加高于阈值的张力使双链核酸变性。变性的双链核酸和单链核酸(“引物”)孵育，导致所述单链引物的杂交。优选，单链核酸分子的序列和双链核酸分子的至少部分序列互补。当张力下降到中间值附近时，变性双链核酸的两条链可以重新杂交。要获得所述两条链的重新杂交，施加介于10和12pN之间的张力；更优选它是12pN ;甚至更优选，它是IlpN ;仍更优选，它是ΙΟρΝ。根据本专利技术，聚合酶活性在这些张力条件下是有活性的，通过向新链中掺入核苷酸导致引物的延伸。最优选地，双链核酸是发夹。如此处所用，“发夹”是指这样的双螺旋，其中一条链的5’端通过未配对的环物理连接到另一条链的3’端。所述物理连接可以是共价或非共价的。优选地，所述物理连接是共价键。因此，发夹由双链茎和未配对的单链环组成。在发夹中，两条链的未参与到环中的端是游离的，因此可被拉开。这导致双链核酸的未配对，从而产生变性的双链核酸分子。有可能通过用高于阈值的力拉所述核酸分子的每一端而完全打开发夹双链本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.05.27 EP 10305563.8;2010.08.27 US 61/377,6211.一种用于测定核酸序列的方法，所述方法包括步骤: a)使对应于所述核酸序列的双链核酸分子变性； b)单链核酸分子(“引物”)和所述变性的双链核酸分子杂交； c)向b)中获得的杂交的引物/双链核酸分子施加张力； d)将步骤b)中获得的杂交的引物/双链核酸分子与聚合酶在导致复制中至少一个暂停的条件下进行孵育；以及 e)确定所述暂停在复制中相对于双链核酸一端的位置。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述双链核酸分子是发夹。3.根据权利要求1或2任一项所述的方法,其中双链核酸其中一条链的至少一个碱基直接或间接地附着至表面，以及其中双链核酸的另一条链的至少一个碱基附着至可移动的表面。4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中通过移开支持物使得双链核酸在步骤a)中变性。5.根据权利要求4所述的方法，其中通过移开支持物来向双链分子施加高于或等于15pN，优选高于或等于17pN，更优选高于或等于ISpN的物理力。6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤c)的所述张力介于12pN和IOpN之间。7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中未附着至支持物的双链核酸的端共价或非共价地彼...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·邦西蒙，V·克罗凯特，JF·阿勒芒，M·马诺萨斯，丁方圆，
申请(专利权)人：国家科学研究中心，巴黎高等师范学院，
类型：
国别省市：