一种改造芽孢杆菌基因组的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种改造芽孢杆菌基因组的方法。本发明专利技术具有适应性广(质粒转化难度低，pBTS质粒可以在多种革兰氏阳性菌中进行复制，改造多种菌的基因组)，可以反复多次改造同一菌株(重组质粒具有两个同源重组片段，依次发生两次同源重组，第二次同源重组后可能恢复到野生型，也可以得到改造菌株，但是不残留任何影响继续改造的片段，如抗性标记、质粒复制元件等)，并且可以改造对细菌生长影响较大的基因(引入cre重组酶和第二种抗性标记系统，可依靠抗性筛选第二次重组得到的改造菌株，杀死生存能力强的野生型菌株，之后表达cre重组酶，切割掉第二种抗性标记，残留的片段不会影响再次对菌株进行改造)。

【技术实现步骤摘要】
一种改造芽孢杆菌基因组的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种改造芽孢杆菌基因组的方法。
技术介绍
蛋白表达技术是现代生物学的核心技术之一，表达蛋白不仅可用于生物学研究，也可以提供商业化的蛋白制品，如重组疫苗、重组胰岛素、细胞因子等产品。目前常用的表达系统有大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等，但是它们都各有明显的优缺点。大肠杆菌表达系统研究最充分，有多种选择，最常用的是Novagen的pET表达系统，其利用噬菌体的T7RNA聚合酶可专一性地转录T7启动子后的目的基因。在最佳条件下，目的蛋白可以达到大肠杆菌总蛋白的50％以上。尽管具有表达效率高，培养成本低等优点，但是缺点也非常明显：蛋白容易形成包涵体，复性难度和成本较高；大肠杆菌不能对蛋白进行糖基化修饰；细胞壁含有脂多糖(内毒素)，不易完全去除。另外一个常用的表达系统是酵母表达系统，其具有表达量高，可诱导，蛋白分泌到胞外易于纯化，并且具有一定的翻译后修饰能力等优点，但是缺点是部分表达产物易降解，表达量不可控，大于30KDa的蛋白几乎不能分泌。动物细胞和昆虫细胞表达系统的特点是具有完整的修饰系统，表达产物具有或者类似的天然活性，没有内毒素污染，但是表达量低，周期长，技术要求高，生产成本高。枯草芽孢杆菌是一种广泛存在于水体、空气、土壤中的革兰氏阳性菌，其可以在环境不适宜的时候产生孢子，孢子可以抵御高温、干旱等极端环境，待环境适宜时再萌发进行营养生长。枯草芽孢杆菌的分泌能力强，在进行高密度发酵时，蛋白分泌量可以达到20—25g/L。其发酵生产的蛋白酶、淀粉酶、次黄嘌呤核苷、核糖甙等产品，早已经进入我们的日常生活。由于其具有生物安全性，被FDA评委GRAS类添加剂，其生产的益生菌及利用其生产的发酵产品已广泛应用于医药和养殖业中。上世纪八十年代就开始利用枯草芽孢杆菌进行蛋白表达，其表达产物不仅包括细菌来源的各种酶类，如淀粉酶、蛋白酶、内葡聚糖酶、脂肪酶等，还包括hEGF、IFN-alpha2、Proinsulin、Streptavidin、cathelicidin-BF等不同来源的蛋白。利用枯草芽孢杆菌的分泌途径，可将表达蛋白分泌到发酵液中，极大地降低了后期分离纯化的难度。枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，不含有脂多糖，便于生产注射用药品。枯草芽孢杆菌的营养要求简单，由于其已经实现规模工业化生产，大规模培养技术难度低，培养成本低。目前，枯草芽孢杆菌中的多个菌株及芽孢杆菌属中的多个种都已经完成了基因组测序工作，遗传背景清楚，安全性高，也便于进行基因组改造。但是枯草芽孢杆菌表达系统并不是一个广泛应用的表达系统，还有许多缺点待克服。枯草芽孢杆菌的模式菌168菌的野生型菌株已经丢失，目前可以得到的菌株都是其突变体。尽管其满足于科学研究的要求，但是其蛋白分泌能力差，是营养缺陷性突变体的特性，并不能满足建立商业化表达系统的要求。目前建立的转化系统都是基于模式菌株168建立的，尽管野生型来源的菌株和已经生产应用的枯草芽孢杆菌种非常多，不易转化都阻碍了对这些菌株的进一步改造。枯草芽孢杆菌来源的质粒也几乎都是隐形质粒，不易构建载体；来源于其它革兰氏阳性菌的质粒多数都是滚环复制性质粒，在枯草芽孢杆菌中复制不稳定，易丢失，拷贝数较少；这些特性都限制了直接使用质粒构建稳定表达系统的可能性。枯草芽孢杆菌有四种分泌途径，Sec途径、Tat途径、Com系统和ABC转运途径，目前研究较清楚的是Sec途径，一些表达系统也利用Sec途径分泌表达蛋白。但是Sec途径具有调控机制，会抑制不正确折叠的蛋白分泌，而外源蛋白一般折叠较慢，折叠过程需要伴侣蛋白的参与，容易被Sec分泌途径降解。枯草芽孢杆菌还会分泌多达八种蛋白酶到发酵液中，其同样会降解表达的目的蛋白。克服上述缺点的有效途径是：不使用质粒作为目的基因和表达系统元件的载体，直接将目的基因和表达系统元件插入枯草芽孢杆菌基因组中；对其基因组进行改造，敲除一些抑制或者影响蛋白分泌的基因。目前改造枯草芽孢杆菌基因组的方法有两种，第一种是直接转化双链DNA片段进入细胞同时进行同源重组，其对转化效率要求极高，目前仅用于168模式菌。第二种是利用温度敏感质粒，转化具有同源重组片段的温度敏感质粒进入细胞，然后在限制性温度下培养，发生了重组的菌可以通过筛选，未发生同源重组的菌由于质粒丢失，不能通过筛选。该方法的转化和重组步骤分开，降低了对转化效率的要求。可以选择的温敏质粒是pE194，但是该质粒是一个只能在革兰氏阳性菌中进行复制的质粒，不能在大肠杆菌中进行复制，即不能利用大肠杆菌快速地进行质粒构建工作。解决方案之一是构建融合质粒，即pE194和pBR322的融合质粒，该质粒拥有两套复制系统，分别可以在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中进行复制。但是该质粒在大肠杆菌中复制时稳定性差，如果在多克隆位点插入小于1.5k的片段时，质粒可以稳定复制；如果插入片段大于2k，该质粒在复制时就会发生片段丢失的现象。另外一个常用温度敏感质粒是pKS1，该质粒是一个多宿主质粒，可以在多数革兰氏阳性菌和阴性菌中复制，但是该质粒稳定性较差，拷贝数较低。文献(RationalDesignofaPlasmidOriginThatReplicatesEfficientlyinBothGram-PositiveandGram-NegativeBacteria，2010)对pKS1的原始质粒pWV01进行改造，增加了其在大肠杆菌中的稳定性和拷贝数，便于进行载体构建。但是文中并未对改造质粒pBAV1K的温敏特性进行研究，在我们的工作中发现pBAV1K-T5-GFP在枯草芽孢杆菌中的温度敏感复制特性依然存在，但是限制性培养温度从pKS1的37℃升高到45℃。根据pBAV1K-T5-GFP质粒的这些特性，可以开发出一套改造枯草芽孢杆菌基因组的方法。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术提供一种改造芽孢杆菌基因组的方法，利用多宿主高拷贝质粒pBAV1K在大肠杆菌中稳定性高，拷贝数多，易于改造的特性和在芽孢杆菌中的温度敏感复制的特性，构建了一套改造枯草芽孢杆菌基因组的方法，具有适应性广，改造质粒易于转化，可以在多种芽孢杆菌中进行复制，改造多种芽孢杆菌；可以重复改造同一菌株，每次改造后不残留抗性、复制元件等影响下次改造的片段；还可以改造对菌株生长影响较大的基因，引入了cre重组酶和第二抗性筛选标记。解决以上技术问题的本专利技术中的一种改造芽孢杆菌基因组的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)在pBAV1K-T5-GFP质粒的EcoRI和ApaI位点插入多克隆位点(MCS)片段，并且通过同义突变，删除其中的NdeI酶切位点，得质粒pBTS。pBTS质粒可以在多种革兰氏阳性菌中进行复制，改造多种菌的基因组。(2)在MCS位点的左端的酶切位点插入500-800bp的同源重组片段A，右侧酶切位点插入500-800bp的同源重组片段B，中间插入突变片段或目的片段或者不插入任何片段，既两个同源重组区域之间需要改造的片段，得质粒pBTS-X。这里的左端和右端的酶切位点可以是任一酶切位点，只需要保证A在B前面就行；A、B分别代表两段序列，具体可以参见技术路线图，A、B是任意两段序列；突变片段、目的片段可以是任意片段，或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改造芽孢杆菌基因组的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)在pBAV1K‑T5‑GFP质粒的EcoR I和Apa I位点插入多克隆位点片段，并且通过同义突变，删除其中的NdeI酶切位点，得质粒pBTS；(2)在多克隆位点的左端的酶切位点插入500‑800bp的同源重组片段A，右侧酶切位点插入500‑800bp的同源重组片段B，中间插入突变片段、目的片段或不插入任何片段，既两个同源重组区域之间需要改造的片段，得质粒pBTS‑X；(3)通过电转化将pBTS‑X转入芽孢杆菌中，得阳性转化菌株；(4)挑取(3)中的阳性转化菌落进入液体培养基中进行培养，培养温度为45℃，培养时间大于24h；(5)取步骤(4)中菌液100ul—500ul，涂布到含30mg/L卡那霉素的LB平板上，培养温度为45℃，进行过夜培养；(6)挑取步骤(5)中的菌落进入液体培养基中进行培养，每8—16h传代一次，直到筛选到无抗菌株；(7)取步骤(6)中的菌液进行稀释涂板，稀释10

【技术特征摘要】
1.一种改造芽孢杆菌基因组的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)在pBAV1K-T5-GFP质粒的EcoRI和ApaI位点插入多克隆位点片段，并且通过同义突变，删除其中的NdeI酶切位点，得质粒pBTS；(2)在多克隆位点的左端的酶切位点插入500-800bp的同源重组片段A，右侧酶切位点插入500-800bp的同源重组片段B，中间插入突变片段、目的片段或不插入任何片段，既两个同源重组区域之间需要改造的片段，得质粒pBTS-X；(3)通过电转化将pBTS-X转入芽孢杆菌中，得阳性转化菌株；(4)挑取(3)中的阳性转化菌落进入液体培养基中进行培养，培养温度为45℃，培养时间大于24h；(5)取步骤(4)中菌液100ul—500ul，涂布到含30mg/L卡那霉素的LB平板上，培养温度为45℃，进行过夜培养；(6)挑取步骤(5)中的菌落进入液体培养基中进行培养，每8—16h传代一次，直到筛选到无抗菌株；(7)取步骤(6)中的菌液进行稀释涂板，稀释105-106倍，过夜培养；(8)挑取步骤(7)中的菌落进行抗性鉴定，直到获得5-10株无抗菌株；(9)将无抗菌株接种到液体培养基中，过夜培养，抽提细菌基因组，进行PCR鉴定；阳性菌株继续进行测序鉴定，测序鉴定结果为阳性菌株即得芽孢杆菌菌株。2.根据权利要求1所述的一种改造芽孢杆菌基因组的方法，其特征在于：所述步骤(3)中芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168、Z12菌株、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或其它pBTS质粒具有温度敏感复制特性的革兰氏阳性菌。3.根据权利要求2所述的一种改造芽孢杆菌基因组的方法，其特征在于：所述革兰氏阳性菌为肺炎链球菌、乳酸乳球菌或类芽孢杆菌菌株。4.根据权利要求1所述的一种改造芽孢杆菌基因组的方法，其特征在于：所述pBTS核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。5.根据权利要求1所述的一种改造芽孢杆菌基因组的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)在pBTS的多克隆位点左侧端插入400-800bp的同源重组片段A，右侧端插入400-800bp的同源重组片段B，中间插入突变片段或目的片段或不插入片段，再在B与中间的改造片段或者A与中间的改造片段之间插入具有H霉素抗性片段，...

【专利技术属性】
技术研发人员：任钧，唐旭，曹镜，雷蕾，樊超，柴进凯，曹富明，孙楠，范佳，
申请(专利权)人：成都美溢德生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51