本发明专利技术旨在提供一种芽孢杆菌、纤溶酶的制备方法及纤溶酶的应用。所述芽孢杆菌命名为Bacillus tequilensis，其保藏编号为：CGMCC No.11462；所述生产纤溶酶的方法是将菌种芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）（其保藏编号为：CGMCC No.11462）进行发酵培养，从发酵产物中分离纯化得到芽孢杆菌纤溶酶；上述方法制备得到的纤溶酶在溶栓药物中用于激活血液中的纤溶酶原来讲解纤维蛋白。本发明专利技术可应用于食品原料生产及加工领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于发酵工程和生物制药
，具体地说，涉及一种枯草芽孢杆菌、利 用该菌制备纤溶酶的方法及纤溶酶在溶栓药物中的应用。
技术介绍
血栓病是一类严重危害人类健康和生命的疾病，据估计，全世界有血栓病患者约 1500万人，其中每年死于心脑血栓疾病的就高达1200万人，据世界卫生组织（WHO)统计， 由于心肌梗死、脑溢血等血栓性疾病导致的死亡已占到全球总死亡人数的51%，在我国，随 着人们生活水平和生活方式的改变，膳食中高脂肪、高蛋白的过量摄取，血栓性疾病已超过 癌症和糖尿病成为第一大健康杀手。治疗血栓病的药物根据其不同的作用机制可分为： 一、纤溶酶原激活剂，如尿激酶（UK)组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂（tPA)等通过激活血 液中的纤溶酶原来降解纤维蛋白；二、纤维蛋白酶，如蚓激酶、多种蛇毒抗栓酶等，直接降 解血液中的纤维蛋白。微生物一直都是纤溶酶的重要来源，尤其芽孢杆菌属细菌，已经分 离到数十种不同类型的纤溶酶，如分离自Bacillus Subtilis的NK,分离自Bacillus amyloliquefaciens 的 DC4 等，其他如 Bacillus subtilisin Carlsberg， Bacillus cereus等细菌均有报道分离到纤溶酶(在Peng, Yong, Xiaojuan Yang, and Yizheng Zhang. ''Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo.^ Applied microbiology and biotechnology 69.2 (2005): 126-132 有报道），但利用 Bacillus tequilensis 来分离制 备纤溶酶却一直未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，旨在提供一种新型芽孢杆菌 以及利用该芽孢杆菌进行纤溶酶生产的方法，还包括该纤溶酶在在溶栓药物中的应用。 本专利技术所述芽孢杆菌所采用的技术方案是，该菌株命名为 ie识/iJeasis，其保藏编号为：CGMCC No. 11462。 利用上述芽孢杆菌进行纤溶酶生产的方法包括以下步骤：将菌种芽孢杆菌 (SaciWys (其保藏编号为：CGMCC No. 11462)进行发酵培养，从发酵产物中 分离纯化得到芽孢杆菌纤溶酶。 进一步地，所述芽孢杆菌分离自土壤，在完成发酵后，进行如下步骤： (1) 发酵液或固体发酵产物洗脱液中加入75%硫酸铵完全沉淀蛋白； (2) 溶解沉淀，经透析去掉残余硫酸铵分子； (3) 透析结束后以MonoQ强阴离子层析，用NaCl洗脱，收集活性部分； (4) 所得具有活性的纤溶酶经Sepcryal -100凝胶柱层析，收集活性峰，冻干后得到纯 度高于90%的纤溶酶，SDS-PAGE电泳呈单一条带。 更进一步地，在发酵过程中，采用的是液体培养基，该液体培养基为：按比例称取 大豆及MgCl2，添加双蒸水，置于200 ml烧杯中，121°C，20 min灭菌，待冷却得培养基，其 中的大豆、]\%(：12及双蒸水的质量/质量/体积比为w/w/v=10:l:5 ;或者称取蛋白胨：酵母 粉：氯化钠：氯化镁（2:1:2:1)的重量溶于100倍体积（w/v)的蒸馏水中，分装在于200 ml、l/3装液量的三角瓶中，121°C，20 min灭菌，待冷却得培养基。 利用上述方法制备得到的纤溶酶在溶栓药物中的应用，所述纤溶酶在溶栓药物中 用于激活血液中的纤溶酶原来讲解纤维蛋白。 本专利技术的有益效果是：本专利技术方法制备得到的酶可以直接、迅速降解纤维蛋白，具 有良好的血栓溶解作用，分子量较尿激酶小，引发人体免疫反应风险较低，具有开发成临床 药物的重要价值。同时，该酶的生产原材料丰富，成本低廉，制备工艺简单，易放大实现工业 化生产，是一种可用于膳食补充剂和药物的重要溶栓成分。【附图说明】 图1为制备所得高纯度酶经SDS-PAGE电泳后呈单一条带； 图2为使用纤维平板法测定酶活性，经2h后该纤溶酶所产生的纤溶圈。【具体实施方式】 下面，以具体的实施例对本专利技术作更进一步的说明。 (-）芽孢杆菌的分离制备 将采自广东省珠海市的土壤样品，经无菌水稀释，静置取上清，稀释后采用涂板法用纤 维蛋白培养基进行筛选分离(每升培养基含蛋白胨：5g，酵母粉：2g，技术琼脂：18g，脱 脂牛奶：250 ml )，能够在纤维蛋白平板上形成透明圈的菌种单独挑出进一步培养。 对于第一步培养的细菌采用改进后的纤维蛋白平板(纤维蛋白原：5g，硫酸铵： 2g，CaCl2: lg，K2HP04:0.1g，KH2P04:0.1g，MgS0 4: 0.2g)进行复筛，对于能够在次形成 透明圈的菌株进行培养保存。 (二）选取形成透明圈直径最大的菌株，提取其16s rDNA进行测序，测序结果在 NCBI数据库中进行比对，16s rDNA信息为该菌株鉴定的主要依据。其中，在测序中，正向引 物为 27f :5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ；反向引物 1492r :5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。 (三）纤溶酶的制备 实施例一： 称取20克大豆及2 g MgCl2，添加双蒸水10 ml，置于200 ml烧杯中，121°C，20 min 灭菌，待冷却后，接种一环Bacillus tequilensis菌种。32°C，72 h发酵。 发酵完成后将200 ml无菌水加入培养基，搅拌0.5 h，4层纱布过滤除去菌体及 不溶性杂质，其余杂质可使用11500 rpm，20 min离心除去。缓慢加入112 g固体硫酸铵， 搅拌均匀，4°C静置1 h，待酶完全沉淀。 沉淀加入45 ml Na2C03/NaHC03(30 mM pH 9.2)溶液完全溶解，使用分子量为5 kDa或8 kDa的透析袋在Na2C03/NaHC03 (30 mM pH 9. 2)溶液中进行当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种芽孢杆菌，其特征在于：该菌株命名为Bacillus tequilensis，其保藏编号为：CGMCC No.11462。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：辛雄，雷波，蔡宗苇，
申请(专利权)人：辛雄，雷波，蔡宗苇，
类型：发明
国别省市：广东;44
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