本发明专利技术公开了一株短小芽孢杆菌、该菌株的获取方法及该菌株在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用，属于微生物应用技术领域。所述短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）05-5402，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.7418。获取方法包括分离、筛选、纯化工序，首先从烟株或土壤中分离能降解尼古丁的菌株，再用以NNK为唯一碳源和氮源的培养基筛选，最后在培养基平板上纯化即得。菌株的应用包括发酵、接种、降解工序，首先将菌株在25~30℃下培养48~72h得发酵菌剂，于烟叶调制或制丝过程中，将发酵菌剂按烟草重量的3~5%喷施，保持4~7天的降解时间即可。所述菌株能实现烟草特有亚硝胺的高效定向降解，且抗逆性好，简便易得，使用方便，具有较高的推广应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一株短小芽孢杆菌、该菌株的获取方法及该菌株在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用
本专利技术属于微生物应用
，具体涉及一株能实现烟草特有亚硝胺定向降解的短小芽孢杆菌，及其获取方法和在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用。
技术介绍
TSNAs是烟草特有的N-亚硝基类化合物，是烟叶中重要的有害成分，对吸烟者的健康存在严重影响。NNN、NNK, NAB, NAT是烟草和烟气中主要的TSNAs，尤其NNN与NNK均为动物强致癌物，危害极大。影响烟草中TSNAs含量的因素很多，其中主要有烟草类型、烟草组织、栽培方式、调制方法、微生物群落、氮肥施用量、硝酸还原酶及亚硝化酶的活性等。通过这些影响因子的改变可以调控TSNAs的形成量，但目前关于TSNAs降解的方法还不多。因此，针对烟叶调制过程或烟叶制丝过程中，烟叶或烟丝内的水、热交换特点，分离、选育一株抗逆性好，能实现烟草特有亚硝胺定向降解的菌株，同时结合烟叶调制过程或烟叶制丝过程中环境温、湿度变化的阶段性特征，选择适宜的施用方法，对于提高烟草品质，降低烟草特有亚硝胺对人体健康及生活环境带来的危害都具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一株能实现烟草特有亚硝胺定向降解的短小芽孢杆菌。本专利技术的第二目的在于提供所述短小芽孢杆菌的获取方法。本专利技术的第三目的在于提供所述短小芽孢杆菌在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用。本专利技术的第一目的是这样实现的:一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),命名为05-5402，经鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的一个株系，是从烟株组织或植烟土壤中分离得到，已于2013年4月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称06110:，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号为CGMCC N0.7418。本专利技术的第二目的是这样实现的:一种所述短小芽孢杆菌的获取方法，包括分离、筛选及纯化工序，具体包括: A、分离:将烟株组织或植烟土壤研磨后加入无菌水，于室温下振荡提取25~35min，得到提取悬浊液，将提取悬浊液用稀释平板的方法分离能在分离培养基上生长的菌株； 培养条件为25~30°C，时间40~55h ； 分离培养基成分以g/L计为:琼脂12.0~18.0、K2HPO4L 4~1.8、KH2PO40.3~0.5、NaCl0.08 ~0.12、MgSO4.7Η200.I ~0.3、CaCl20.04 ~0.06、MnSO4.Η200.001 ~0.003、CuSO4.5Η200.0001、ZnSO4.7Η200.0002、NaMoO4.2Η200.0002、尼古丁 0.8 ~1.2，ρΗ6.5 ~7.5 ； B、筛选:将分离出的菌株转接到筛选培养基平板上，得到一菌落长势旺盛的细菌菌株;培养条件为:25~30°C，时间40~55h ； 筛选培养基成分以g/L计为:琼脂12.0~18.0、K2HPO4L 4~1.8、KH2PO40.3~0.5、NaCl0.08 ~0.12、MgSO4.7Η200.I ~0.3、CaCl20.04 ~0.06、MnSO4.Η200.001 ~0.003、CuSO4.5Η200.0001、ZnSO4.7Η200.0002、NaMoO4.2Η200.0002,NNK0.8 ~1.2，ρΗ6.5 ~7.5 ; C、纯化:将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，即短小芽抱杆菌(Bacillus pumilus)05-5402 ; 培养条件为:25~30°C，时间40~55h ； 纯化培养基成分以g/L计为:蛋白胨8.0~12.0、牛肉浸膏2.0~4.0、NaC14.0~6.0、琼脂 15.0 ~19.0, ρΗ7.0 ~7.5。本专利技术的第三目的是这样实现的:一种所述短小芽孢杆菌在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用，包括发酵、接种及降解工序，具体包括: a、发酵:首先将短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)05-5402接种到斜面培养基上，得到发酵种子； 培养条件为:25~30°C，时间24~36h ； 斜面培养基成分以g/L计为:蛋白胨8.0~12.0、牛肉浸膏2.0~4.0、NaC14.0~6.0、琼脂 15.0 ~19.0, ρΗ7.0 ~7.5。然后将发酵种 子接种到种子培养液中，接种量为3~5ν/ν%,摇瓶装液量为25~35ν/ν%，得到发酵菌剂； 培养条件为:25~30°C，时间24~36h ； 种子培养液成分以g/L计为:胰蛋白胨8.0~12.0、酵母浸膏4.0~6.0、NaC14.0~6.0 ； b、接种:在烟叶调制或制丝过程中，将发酵菌剂按照烟叶或烟丝重量的3~5%进行喷施； C、降解:喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝需保持4~7天的降解时间，即可实现烟叶或烟丝中NNN、NNK, NAB和NAT的有效降解。本专利技术所述短小芽孢杆菌可应用于烟草特有亚硝胺的定向降解，具有以下优点: 1、本专利技术所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)05-5402是一种烟草特有亚硝胺的高效降解菌，对调制或制丝过程烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT四种主要TSNAs的总降解率可达12.2~17.3%。2、本专利技术所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)05-5402大量存在于烟株与土壤中，来源广泛，易于分离、培养。同时，生产工艺简单，成本低廉，使用便利，且对人体无害，有利于该菌株的工业化生产和应用普及。3、本专利技术所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)05-5402能在含有O~80g/LNaCl，pH3.0~10.0的培养基中生长，生长温度范围为10~45°C，具有良好的抗逆性，能充分适应烟叶调制和制丝过程中的温、湿度环境变化和水、热交换特点，定殖效果好，活性高。【具体实施方式】下面对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或改进，均落入本专利技术的保护范围。一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)05-5402,已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC N0.7418。所述菌株为革兰氏阳性，芽孢椭圆形中生或端生，不膨大，芽孢比菌体小，存在于菌体中，在培养基上菌落呈圆形，直径2~3mm，扁平无凸起，乳白色，有光泽，边缘不整齐，为好氧菌。所述菌株可在含有O~80g/L NaCl, pH3.0~10.0的培养基中生长，生长温度范围为10~45°C。所述菌株可在以NNK为唯一碳源和氮源的培养基中生长。所述NNK指的是4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基_1_ 丁酮(4_ (N-NITR0S0METHYLAΜΙΝ0)-1-(3-PYRIDYL)-1-BUTAN0NE)。所述菌株对调制或制丝过程烟叶或烟丝中NNN、NNK, NAB和NAT的总降解率为12.2 ~17.3%。一种所 述短小芽孢杆菌的获取方法，包括分离、筛选及纯化工序，具体包括: A、分离:将烟株组织或植烟土壤研磨后加入无菌水，于室温下振荡提取25~35min，得本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株短小芽孢杆菌（Bacillus?pumilus）05?5402，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC?No.7418。
【技术特征摘要】
1.一株短小芽孢杆菌Cfeci77w5./7--Υ7?5.) 05-5402,已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC N0.7418。2.如权利要求1所述的短小芽孢杆菌，其特征在于所述菌株可在以4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1- 丁酮为唯一碳源和氮源的培养基中生长。3.如权利要求1或2所述的短小芽孢杆菌，其特征在于所述菌株对调制或制丝过程烟叶或烟丝中NNN、NNK, NAB和NAT的总降解率为12.2~17.3%。4.一种权利要求3所述的短小芽孢杆菌的获取方法，包括分离、筛选及纯化工序，具体包括: A、分离:将烟株组织或植烟土壤研磨后加入无菌水，于室温下振荡提取25~35min，得到提取悬浊液，将提取悬浊液用稀释平板的方法分离能在分离培养基上生长的菌株； 培养条件为:25~30°C，时间40~55h ； 分离培养基成分以 g/L 计为:琼脂 12.0-18.0、K2HPO4 1.4^1.8、KH2PO4 0.3^0.5、NaCl0.08~0.12、MgSO4.7Η20 0.1~θ.3、CaCl2 0.04~0.06、MnS04.H20 0.ΟΟ1~Ο.003、CuSO4.5Η200.0001、ZnSO4.7Η20 0.0002、NaMoO4CH2O 0.0002、尼古丁 0.8~1.2，pH 6.5~7.5 ； B、筛选:将分离出的菌株转接到筛选培养基平板上，得到一菌落长势旺盛的细菌菌株; 培养条件为:25~30°C，时间40~55h ； 筛选培养基成分以 g/L 计为:琼脂 12.0-18.0、K2HPO4 1.4^1.8、KH2PO4 0.3^0.5、NaCl0.08~0.12、MgSO4.7Η20 0.1~0.3、CaCl2 0.04~0.06、MnS04.H20 0.001~0.003、CuSO4.5Η200.0001、ZnSO4.7Η20 0.0002、NaMoO4.2Η20 0.0002、NNK 0.8~1.2，pH 6.5~7.5 ； C、纯化:将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，即短小芽抱杆...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏振远，雷丽萍，汪安云，吴玉萍，莫笑晗，马雁军，周俊，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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