生产丙酮酸的菌株及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种生产丙酮酸的菌株及其构建方法，其构建方法如下：将D-氨基酸氧化酶基因DAAO通过EcoRI或BamHI克隆在pUC57质粒中获得质粒pUC57-DAAO，以质粒pUC57-DAAO为模板进行基因扩增，将基因DAAO扩增获得的产物克隆至质粒pET28a或pET21a中，选取培养得到质粒中连接上含有DAAO的DNA片段的阳性克隆质粒，将上述构建好的阳性克隆质粒转化进表达宿主菌BL21(DE3)中，选取培养得到能够将D-丙氨酸转化为丙酮酸的第一菌株；D-氨基酸氧化酶基因DAAO片段大小为1124bp，含有核酸内切酶NdeI和EcoRI的酶切位点。上述构建得到的菌株能够直接通过生物转换法将D-丙氨酸转化为丙酮酸。

【技术实现步骤摘要】
生产丙酮酸的菌株及其构建方法
本专利技术涉及一种丙酮酸的生产领域，具体而言，本专利技术提供了一种用于从生产丙酮酸的菌株及该菌株的构建方法。
技术介绍
丙酮酸是一种α-酮酸，在生物化学代谢途径中扮演重要的角色。作为一种重要的有机酸，丙酮酸不仅是人体三羧酸循环和氨基酸合成过程中重要的中间体，同时在食品、化工和制药工业及科学研究中有着广泛的用途。在制造工业中，常被用作食品添加剂、重量控制添加剂、保健食品和抗氧化剂等。同时，因为丙酮酸既具有活性的酮基又具有活性羧基基团，因此常被作为一种重要的原材料广泛的用于化工、制药和农业化学品生产中，如其可以作为合成L-酪氨酸、N-乙酰-D-甘露糖胺丙酮酸及（R）-苯乙酰甲醇等制药前体的原料。目前丙酮酸的生产方法主要有化学法和生物法。其中，化学法生产丙酮酸在工业上主要是通过使酒石酸脱水和去羰基来合成。这种生产丙酮酸的方法操作简单，但是污染重、成本高。生物法生产丙酮酸主要包括直接发酵、酶催化法和全细胞转化法。发酵生产丙酮酸的菌株包括多种维生素缺陷型的酵母Torulopsisglabrata、硫辛酸缺陷性的大肠杆菌和酵母菌株。目前酵母菌发酵生产的丙酮酸产量最高，可达135g/L，转化率达0.54g/g。另外，重组大肠杆菌YYC202发酵生产丙酮酸的最高产量为110g/L，转化率为0.87g/g。发酵法生产丙酮酸有很多缺陷。由糖发酵生产丙酮酸的产率一直较低。另外，从发酵液中分离丙酮酸是一个复杂而且昂贵的过程。生物催化法作为一种替代方法应运而生。生物催化法生产丙酮酸可以通过全细胞催化或者酶催化完成。其中，全细胞催化生产丙酮酸是通过生物催化底物直接进行转化，不需要复杂的生长培养基，减少了下游分离纯化的成本。例如，在优化条件下，使用Pseudomonassp.g31菌株进行生物转化，能够在24h内将100mM的富马酸转化为94mM的丙酮酸。另外，使用大肠杆菌YYC202进行全细胞转化由葡萄糖生产丙酮酸，最高转化率为0.93g/g，这是发酵生产无法达到的。实现工业化生物转化法生产丙酮酸的关键是使用价格低于丙酮酸的原材料通过高效的转化方法进行生产。目前，可用于生物催化法生产丙酮酸的底物主要包括D-丙氨酸、1，2-丙二醇，延胡索酸以及乳酸等。目前，已经有多种涉及的关键酶基因被克隆并进行了研究，但是使用这些酶进行生物转化的条件还未优化。为了实现全细胞催化法生产丙酮酸，需要选择从较低成本的原材料出发，通过设计高效的生物催化途径实现丙酮酸生产，并通过对反应途径中关键酶蛋白活性进行优化以及对生物转化条件的优化来获得高效生物催化生产丙酮酸的方法。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是提供一种生产丙酮酸的菌株及其构建方法，其可有效的用于生物转换法生产丙酮酸。一种生产丙酮酸菌株的构建方法，其构建方法如下：将D-氨基酸氧化酶基因DAAO通过EcoRI或BamHI克隆在pUC57质粒中获得质粒pUC57-DAAO，以质粒pUC57-DAAO为模板进行基因扩增，将基因DAAO扩增获得的产物克隆至质粒pET28a或pET21a中，选取培养得到质粒中连接上含有DAAO的DNA片段的阳性克隆质粒，将上述构建好的阳性克隆质粒转化进表达宿主菌BL21(DE3)中，选取培养得到能够将D-丙氨酸转化为丙酮酸的第一菌株；D-氨基酸氧化酶基因DAAO片段大小为1124bp，含有核酸内切酶NdeI和EcoRI的酶切位点。上述构建得到的菌株能够直接通过生物转换法将D-丙氨酸转化为丙酮酸。附图说明图1为质粒pET28a-RgDAAO的示意图；图2为质粒pACYCDuet-1-katE-alaR的示意图。具体实施方式以下实施例是对本专利技术的进一步的说明，并不构成对本专利技术实质内容的限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买得到。操作1D-氨基酸氧化酶基因的合成与克隆D-氨基酸氧化酶（D-aminoacidoxidase，DAAO）的合成与克隆，分为以下几个操作：步骤1：D-氨基酸氧化酶（D-aminoacidoxidase，DAAO）的全基因合成：通过全基因合成法，分别合成来自Cyprinuscarpio、Rhodotorulagracilis和Trigonopsisvariabilis的D-氨基酸氧化酶基因。基因合成由金唯智生物科技（北京）有限公司完成。合成的基因通过EcoRV克隆在pUC57质粒中。三个基因分别命名为CcDAAO、RgDAAO和TvDAAO。合成的三个基因的序列分别为：CcDAAO:A273T255C254G262|GC%:49.43%|Length:1044ATGAGGGTGTGCATCATTGGAGCGGGGGTCATCGGCCACTCCACTGCTCAGAGCATCTACCAGCACTTCCACGACAGGATCGCCCCTCTCACCATAGAGGTGTATGCTGATGTCTTCACTCCACTCACCACCAGCGACGGGGCAGCTGGACTCTGGCAGCCGTATCTCTATGACAAGGGGAATGTGCAAGAAACTAAATGGAACAAAGAGACGTTTCAGTATCTACTAAGTTGCCTCAGCTCTCCAGATTCTGTGAGAATGGGAATCTTCCTCCAGTCTGGCTATAATCTGTGCACTGAACCCCTGCCGGACCCCTCATTTAAAGACACTGTGTTGGGCTTTCGCAAGCTGACTCAACGTGAACTAGACATGTTCCCAGGATACAGTTTTGGGTGGTTCAACACTGCTCTCATGGTTGAAGGAAAAACATACCTGCCCTGGCTTATGGACTGGCTAAGACAAAGAAAGGTCAAGTTTTATCAGAGGAAGATTGGTTCATTTAAAGAGCTGGCAGACATCGGTGCTGATGTTATCATCAACTGCTCTGGTGTACGATCAGGAGACCTTCAGCCTGATCCTGAGCTCCAGCCAGGCAGAGGACAGATCATTAAGGTAGACGCTCCCTGGTTAAAACACTGGATCCTTACACATGATTCCTCATCAGGAGTTTATAACTCACCGTACATCATTCCTGGGAGTCGTTTAGTCACTGTGGGTGGAGTTTTCCAAATAGGAAACTGGAATCTGCAGAACAGTTCTGTGGACCATAAAGGAATCTGGGAAGCTGCCTGCAAGCTTGATCCCAGTCTACAGCATGCGCGGATAGTAGAGGACTGGACTGGTCTCAGGCCTGCACGCAGCAAAGTTAGACTGGAGAGAGAGACCATACGATCTGGACCAACCTCATTTGAGGTCATTCATAACTACGGACATGGAGGTTTTGGACTGACCATCCATCGTGGATGTGCTGAGGAAGCTGCTCGTCTCTTTGGTCAGATCCTGGAGCAGAAAGGCCTGCTAGCACACTCTAAATCACGTCTCTAACcDAAO的核苷酸序列如SEQIDNO.11本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产丙酮酸菌株的构建方法，其构建方法如下：将D‑氨基酸氧化酶基因DAAO通过EcoRI或BamHI克隆在pUC57质粒中获得质粒pUC57‑DAAO，以质粒pUC57‑DAAO为模板进行基因扩增，将基因DAAO扩增获得的产物克隆至质粒pET28a或pET21a中，选取培养得到质粒中连接上含有DAAO的DNA片段的阳性克隆质粒，将上述构建好的阳性克隆质粒转化进表达宿主菌BL21(DE3)中，选取培养得到能够将D‑丙氨酸转化为丙酮酸的第一菌株；D‑氨基酸氧化酶基因DAAO片段大小为1124bp，含有核酸内切酶NdeI和EcoRI的酶切位点。

【技术特征摘要】
1.一种生产丙酮酸菌株的构建方法，其构建方法如下：将D-氨基酸氧化酶基因DAAO通过EcoRI或BamHI克隆在pUC57质粒中获得质粒pUC57-DAAO，以质粒pUC57-DAAO为模板进行基因扩增，将基因DAAO扩增获得的产物克隆至质粒pET28a或pET21a中，选取培养得到质粒中连接上含有DAAO的DNA片段的阳性克隆质粒，将上述构建好的阳性克隆质粒转化进表达宿主菌BL21(DE3)中，选取培养得到能够将D-丙氨酸转化为丙酮酸的第一菌株；D-氨基酸氧化酶基因DAAO片段大小为1124bp，含有核酸内切酶NdeI和EcoRI的酶切位点；D-氨基酸氧化酶基因DAAO为RgDAAO；质粒pUC57-DAAO为质粒pUC57-RgDAAO，所述的RgDAAO来自Rhodotorulagracilis的D-氨基酸氧化酶基因；RgDAAO的序列为：ATGCACTCGCAGAAGCGCGTCGTTGTCCTCGGATCAGGCGTTATCGGTCTGAGCAGCGCCCTCATCCTCGCTCGGAAGGGCTACAGCGTGCATATTCTCGCGCGCGACTTGCCGGAGGACGTCTCGAGCCAGACTTTCGCTTCACCATGGGCTGGCGCGAATTGGACGCCTTTCATGACGCTTACAGACGGTCCTCGACAAGCAAAATGGGAAGAATCGACTTTCAAGAAGTGGGTCGAGTTGGTCCCGACGGGCCATGCCATGTGGCTCAAGGGGACGAGGCGGTTCGCGCAGAACGAAGACGGCTTGCTCGGGCACTGGTACAAGGACATCACGCCAAATTACCGCCCCCTCCCATCTTCCGAATGTCCACCTGGCGCTATCGGCGTAACCTACGACACCCTCTCCGTCCACGCACCAAAGTACTGCCAGTACCTTGCAAGAGAGCTGCAGAAGCTCGGCGCGACGTTTGAGAGACGGACCGTTACGTCGCTTGAGCAGGCGTTCGACGGTGCGGATTTGGTGGTCAACGCTACGGGACTTGGCGCCAAGTCGATTGCGGGCATCGACGACCAAGCCGCCGAGCCAATCCGCGGGCAAACCGTCCTCGTCAAGTCCCCATGCAAGCGATGCACGATGGACTCGTCCGACCCCGCTTCTCCCGCCTACATCATTCCCCGACCAGGTGGCGAAGTCATCTGCGGCGGGACGTACGGCGTGGGAGACTGGGACTTGTCTGTCAACCCAGAGACGGTCCAGCGGATCCTCAAGCACTGCTTGCGCCTCGACCCGACCATCTCGAGCGACGGAACGATCGAAGGCATCGAGGTCCTCCGCCACAACGTCGGCTTGCGACCTGCACGACGAGGCGGACCCCGCGTTGAGGCAGAACGGATCGTCCTGCCTCTCGACCGGACAAAGTCGCCCCTCTCGCTCGGCAGGGGCAGCGCACGAGCGGCGAAGGAGAAGGAGGTCACGCTTGTGCATGCGTATGGCTTCTCGAGTGCGGGATACCAGCAGAGTTGGGGCGCGGCGGAGGATGTCGCGCAGCTCGTCGACGAGGCGTTCCAGCGGTACCACGGCGCGGCGCGGGAGTCGAAGTTGTAG；基因RgDAAO进行基因扩增和克隆所选用的引物分别如下：以来自ATCC、编号23857的枯草芽孢杆菌168的基因组DNA为模板，基因扩增枯草芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶基因alaR，将基因alaR扩增获得的产物克隆到质粒pACYCDuet-1的NdeI和XhoI酶切位点构建得到质粒pACYCDuet-1-alaR；以来自ATCC、编号8739的大肠杆菌的基因组DNA为模板，基因扩增大肠杆菌的过氧化氢酶基因katE，将基因katE扩增获得的产物克隆到质粒pACYCDuet-1-alaR的SacI和SalI酶切位点构建得到质粒pACYCDuet-1-katE-alaR；将构建得到的质粒pACYCDuet-1-katE-alaR电转化入第一菌株中，构建获得能够将L-丙氨酸转化为丙酮酸的第二菌株；基因alaR、katE进行基因扩增和克隆所选用的引物分别如下：2.如权利要求1所述的生产丙酮酸菌株的构建方法，其特征在于，质粒pUC57-DAAO为模板进行DAAO基因扩增的具体操作为：扩增体系为：NewEnglandBiolabsPhusion5X缓冲液10μl、dNTP1μl且每种dNTP各10mM、DNA模板20ng、10μM的引物各2μl、2.5U/μl的PhusionHigh-FidelityDNA聚合酶0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl；扩增条件为：98℃预变性2分钟，1个循环；98℃变性10秒、56℃退火10秒、72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸10分钟，1个循环；DAAO基因扩增产物克隆至pET28a或pET21a质粒中的具体操作为：将基因DAAO扩增获得的DAAO基因的PCR片段进行清洗纯化，获得含有DAAO基因的DNA片段，共1124bp；酶切体系为：0.2μg的DAAODNA片段，2μl10*CutSmartBuffer，1μlNdeI，1μlEcoRI-HF，补充蒸馏水至20μl，37℃温浴10分钟，然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有DAAO的DNA片段；质粒pET28a或pET21a的酶切体系：1μg的质粒pET28a或pET21a，2μl10*CutSmartBuffer，1μlNdeI，1μlEcoRI-HF，补充蒸馏水至20μl，37℃温浴10分钟，然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有pET28a的DNA片段；连接体系：10ng酶切回收的pET28a片段，20ngRgDAAO的DNA片段，2μlQuickLigationReactionBuffer，加蒸馏水补充至10μl，然后加0.5μlQuickT4DNALigase，25℃放置10分钟，取5μl加入50μlTrans1感受态细胞中，冰浴30分钟；42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟；加入250μlLB培养基，200rpm，37℃孵育1小时；取200μl菌液涂在含有终浓度为50ug/ml的卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学礼，张冬竹，
申请(专利权)人：合肥百迈生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34