一种高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于微生物基因工程技术领域，具体地，本发明专利技术涉及一种高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和应用。本发明专利技术所提供的基因工程菌是按照包括以下步骤的方法构建的：在出发大肠杆菌中弱化磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和柠檬酸合酶活性，构建得到大肠杆菌基因工程菌YP02。本发明专利技术所构建的大肠杆菌基因工程菌菌株YP02，在好氧条件下，利用无机盐培养基发酵36小时，可将89g/L葡萄糖转化生成65g/L丙酮酸，转化率达到0.73g/g葡萄糖；而且与出发菌株相比，主要副产物浓度明显降低，其中α‑酮戊二酸为2.5g/L，富马酸为0.4g/L，柠檬酸为0.6g/L，适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物基因工程
，具体地，本专利技术涉及一种高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
丙酮酸(Pyruvic acid)，浅黄色至黄色透明液体，是生物体基本代谢中间产物之一，广泛应用于食品添加剂、农药、医药等领域。可作为前体，酶法合成L-色氨酸、L-酪氨酸、D/L-丙氨酸和L-二羟基苯丙氨酸等，同时在减肥、增强耐力、降低胆固醇等人类健康领域有应用潜力。发酵法生产丙酮酸的研究开始于二十世纪90年代，日本、美国等发达国家在菌株选育、工程菌株构建、分离纯化等方面开展了一系列的工作，我国的相关研究主要由江南大学和中国科学院微生物研究所等单位开展，也取得了不错的进展。减弱丙酮酸的降解途径是实现丙酮酸积累的主要思路。目前发酵菌株研究最多的是光滑球拟酵母(Torulopsis glabuata)和大肠杆菌(Escherichia coli)基因工程菌。日本学者Yonehara等筛选出一株多种维生素营养缺陷型光滑球拟酵母T.glabuata IFO 005，经过诱变后，丙酮酸得率可达到0.52-0.54g/g[JP,patent 2000078996]。采用分批补料方式培养63小时，丙酮酸浓度达到67.8g/L[J.Ferment.Bioeng.,1996,82(5):475-479]。刘立民等在高浓度NaCl溶液中驯化得到一株高盐耐受菌株T.glabuata RS23，培养82小时，丙酮酸浓度可达到94.3g/L，葡萄糖转化率达到0.635g/g[Biotech.Bioeng.,2007,97(4):825-832]。与采用筛选、驯化手段改造酵母相比，产丙酮酸大肠杆菌构建主要采用基因工程技术，通过直接将丙酮酸降解途径失活来实现。Ingram等以E.coli W3110为出发菌株，通过敲除ldhA、poxB、ackA、pflB、adhE、frdBC、sucAB、atpFH基因，在阻断乙酸合成，减弱TCA代谢流的同时，增强糖酵解途径的代谢强度，实现菌体生物量和CO2产生量降低，积累丙酮酸达到66g/L，转化率和生产强度分别达到0.75g/g、1.2g/Lh[PNAS,2004,101(8),2235-2240]。Eiteman等采用类似的思路，通过敲除aceEF、pfl、poxB、pps、ldhA、atpFH、arcA基因，批次补料培养44h，丙酮酸浓度达到90g/L，转化率和生产强度分别达到0.68g/g、2.1g/Lh[Appl.Environ.Microbiol.,2008,74(21),6649-6655]。中国科学院过程工程研究所通过调控脂肪酸代谢途径，增强糖酵解途径的同时，降低TCA循环强度，得到丙酮酸生产菌株YP01，发酵48小时获得69g/L的丙酮酸。但在发酵过程中仍有较大量的副产物酸生成，主要包括丁二酸、富马酸、酮戊二酸等，副产物酸的总浓度达到丙酮酸浓度的20％-30％。大量副产物的生成不仅降低丙酮酸的产率，也会大幅度的提高后续的纯化成本。分析副产物酸的组成后发现，TCA途径中的中间代谢物是副产物的主要成分，因此降低TCA途径的代谢强度从而减少副产物酸的积累是菌株改造的重点。在已报道的文献中，多种方法可以降低TCA途径的代谢强度。例如敲除ATP合成酶基因atpFH，使ATP的生成与跨膜电子传递解偶联，降低ATP的生成量，减弱TCA途径强度。还比如敲除sucA基因，使酮戊二酸转化为丁二酸乙酰辅酶A的反应弱化，从而弱化TCA途径。这些途径可以降低TCA途径中副产物酸的产量，但改造菌株的生长都会受到严重影响，降低丙酮酸的生产速率。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供可以高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌。本专利技术的另一个目的是提供上述高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程的构建方法。本专利技术的再一个目的是提供上述高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌的应用。本专利技术的再一个目的是提供一种生产丙酮酸的方法。本专利技术提供的大肠杆菌(Escherichia coli)基因工程菌YP02，其菌种保藏编号为CGMCC No.12463。本专利技术的上述大肠杆菌基因工程菌YP02的构建方法，包括以下步骤：1)在出发大肠杆菌中弱化磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)的活性，得到重组大肠杆菌，记作重组大肠杆菌Ⅰ；2)所述重组大肠杆菌Ⅰ中弱化柠檬酸合酶(gltA)的活性，得到重组大肠杆菌，记作重组大肠杆菌Ⅱ，即大肠杆菌基因工程菌YP02。所述大肠杆菌基因工程菌YP02保存时间：2016年5月18日，保存单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物生物中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC No.12463。所述出发大肠杆菌为已经使丙酮酸氧化酶、乙酸激酶和乙酰磷酸化酶失活的大肠杆菌，命名为YPⅠ。所述出发大肠杆菌优选使用现有的大肠杆菌K-12MG1655。所述弱化磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性是使所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因的起始密码子由ATG变为GTG；所述使所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因的启始密码子替换的方法包括以下步骤：向所述出发大肠杆菌中导入序列表中SEQ ID NO.3所示DNA；SEQ ID NO.3:所述序列表中SEQ ID NO：3所示DNA与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因发生同源重组；所述弱化柠檬酸合酶的活性包括使所述柠檬酸合酶基因编码基因的启始密码子由ATG变为GTG；所述使所述柠檬酸合酶编码基因的启始密码子替换的方法包括以下步骤：向所述重组大肠杆菌Ⅰ中导入序列表中SEQ ID NO.6所示DNA；SEQ ID NO.6:所述序列表中SEQ ID NO：6所示DNA与所述出发大肠杆菌中的柠檬酸合酶编码基因片段发生同源重组。本专利技术还提供了一种重组大肠杆菌，即上述的重组大肠杆菌Ⅰ，所述重组大肠杆菌由替换出发大肠杆菌中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的起始密码子ATG为GTG获得；其中，所述出发大肠杆菌为已经使丙酮酸氧化酶、乙酸激酶和乙酰磷酸化酶失活的大肠杆菌。本专利技术还提供了上述大肠杆菌基因工程菌YP02的应用，尤其是其在生产丙酮酸中的应用。本专利技术提供的生产丙酮酸的方法，包括以下步骤：发酵上述大肠杆菌重组基因工程菌YP02，生产得到丙酮酸，其中，所述发酵温度为35-38℃；所述发酵体系的pH值为6.5-7.5所述发酵时间为20小时-60小时；所述发酵接种量的体积百分比为0.1％-10％；所述发酵培养基中的碳源可以是下述的一种或几种：葡萄糖、木糖、淀粉；所述发酵培养基中的氮源可以是下述的一种或几种：酵母膏、蛋白胨、玉米浆、糖蜜、氨水、铵盐、尿素。本专利技术所构建的大肠杆菌基因工程菌菌株YP02，在好氧条件下，利用无机盐培养基发酵36小时，可将89g/L葡萄糖转化生成61g/L丙酮酸，菌体的生长不受影响，副产物酸浓度明显降低，酮戊二酸为2.5g/L，富马酸为0.4g/L，柠檬酸为0.6g/L。本专利技术以已经阻断乙酸主要合成途径的大肠杆菌为出发菌株，通过起始密码子的弱化，降低进入TCA循环的碳流，减慢TCA途径的整体代谢速率，达到积累丙酮酸的目的。本专利技术中构建的大肠杆菌基因工程菌发酵副产物明显降低，丙酮酸的转化率提高。附图说明图1为大肠杆菌合成丙酮酸代谢途径改造示意图。图2为本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌YP02(Escherichia coli)，其特征在于，所述大肠杆菌基因工程菌的菌种保藏编号为CGMCC No.12463。

【技术特征摘要】
1.一种高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌YP02(Escherichia coli)，其特征在于，所述大肠杆菌基因工程菌的菌种保藏编号为CGMCC No.12463。2.一种权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌YP02的构建方法，所述方法包括以下步骤：1)采用同源重组技术，替换出发大肠杆菌菌株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的起始密码子ATG为GTG，获得重组大肠杆菌命名为重组大肠杆菌Ⅰ；其中，所述出发大肠杆菌为已经使丙酮酸氧化酶、乙酸激酶和乙酰磷酸化酶失活的大肠杆菌；2)采用同源重组技术，将重组大肠杆菌Ⅰ中的柠檬酸合酶的起始密码子ATG替换为GTG，命名为重组大肠杆菌Ⅱ，即大肠杆菌基因工程菌YP02。3.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌由替换出发大肠杆菌中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨茂华，王钦宏，邢建民，穆廷桢，钟伟，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11