一种提高大肠杆菌合成血红素的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高大肠杆菌合成血红素的方法，属于代谢工程技术领域。本发明专利技术通过将来源大肠杆菌的血红素合成途径基因分成两个模块，利用拷贝数不同的质粒，将两个模块随机组合，在过量表达谷氨酰‑tRNA还原酶(hemA编码)、谷氨醛氨基转移酶(hemL编码)的基础上，强化了血红素合成途径。本发明专利技术构建的重组大肠杆菌工程菌E.coli DH5α：pUC19‑hemA‑hemL+pACYCDuet‑2‑hemB‑hemC‑hemD‑hemE+pRSFDuet‑2‑hemF‑hemG‑hemH摇瓶发酵培养48h，生产血红素0.56μM/OD细胞。本发明专利技术采用代谢工程策略，改造微生物菌株来合成目的产物血红素，为微生物法高效生产血红素奠定了一定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种提高大肠杆菌合成血红素的方法，属于代谢工程

技术介绍
血红素是含铁卟啉衍生物，由原卟啉与1个二价铁原子构成。其核心是亚铁离子，具有携氧能力，是有氧呼吸及厌氧呼吸电子传递链蛋白的重要组分。除此之外，它还是许多感应调节蛋白和酶的辅基，参与生物细胞中的许多重要的生理生化反应过程，比如电子传递、气体转运、细胞中的信号转导、过氧化物还原等，并且是许多生物体的优质铁源。目前，血红素不仅在食品行业常被用于着色剂，如肠类制品，而且在医学临床上也广泛的使用，如血红素可作为半合成胆红素原料，也可生产抗肝功能亢进、抗炎症作用和抗肿瘤作用的重要药物。血红素也是人类良好的补血剂，亚铁血红素可直接被人体吸收，吸收率高达10％～20％。包括血红素在内的卟啉类化合物的合成可以通过化学合成，但是由于它们结构复杂，合成过程中反应步骤繁琐，得率比较低，使得卟啉类化合物价格昂贵。为此，微生物成为生产结构复杂的卟啉类化合物的最佳选择。随着基因工程技术的成熟，选择大肠杆菌作为宿主大量合成血红素具有广阔的前景。Kwon等人在大肠杆菌中表达来源于类球红细菌的hemA基因合成血红素，并且将其作为老鼠饲料的铁源。此外，Lee等人分别表达了参与泛酸途径的coaA基因和卟啉合成途径的每个基因hemB、hemC、hemD、hemE，获得较高产量的血红素，即使通过优化培养基，但是这个产量对于工业生产来讲，还是非常低。因此，进一步对血红素合成途径进行改造，提高血红素产量是十分必要的。在生物体内，血红素的合成途径是从5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinicacid,ALA)开始的(图1)。ALA是血红素合成途径的关键前体物质。ALA在ALA脱水酶(HemB,由基因hemB编码)的催化下生成胆色素原，然后胆色素原在羟甲基胆素合成酶(HemC,由基因hemC编码)的作用下生成羟甲基胆素，又被尿卟啉原Ⅲ合成酶(HemD,由基因hemD编码)催化生成含有四吡咯环的尿卟啉原Ⅲ，再经过尿卟啉原Ⅲ脱羧酶(HemE,由基因hemE编码)和粪卟啉原Ⅲ氧化酶(HemF,由基因hemF编码；无氧条件下为HemN,由基因hemN编码)的脱羧氧化作用生成原卟啉原Ⅸ，又在偶联呼吸链辅酶Q的原卟啉原氧化酶(HemG,由基因hemG编码)催化下生成原卟啉Ⅸ。原卟啉Ⅸ在亚铁螯合酶(HemH,由基因hemH编码)作用下将铁离子螯合进原卟啉环生成血红素。由于血红素合成途径调控机理复杂，受多方面因素影响。目前有关血红素合成途径的研究，主要集中于分析某单个基因或某几个基因对血红素生产的影响，并未考虑血红素合成途径基因的表达强度与合成血红素之间的关系。ALA是血红素合成途径的关键前体物质，为了进一步促进血红素的积累，本专利技术在在表达5-氨基乙酰丙酸C5合成途径关键酶基因hemL和hemA的基础上，将来源于大肠杆菌血红素生物合成途径的基因分为两个模块，利用拷贝数不同的质粒对两个模块的基因组合表达，实现血红素产量的提高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种提高大肠杆菌工程菌株产血红素的方法，是利用不同拷贝数的表达载体，将血红素合成途径的基因分模块组合表达，实现血红素产量的提高。本专利技术的第一个目的是提供一种高产血红素的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并串联表达hemF、hemG和hemH基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌包括(a),(b)，(c)，其中：(a)是以pRSFDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pACYCDuet-2为载体串联表达hemF、hemG和hemH基因；(b)是以pCDFDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pRSFDuet-2或pACYCDuet-2为载体，串联表达hemF、hemG和hemH基因；(c)是以pACYCDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pRSFDuet-2或pCDFDuet-2为载体，串联表达hemF、hemG和hemH基因；在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还以pUC19为载体过量表达hemA和hemL基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述hemA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述hemL的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述hemB的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述hemC的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述hemD的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述hemE的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述hemF的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述hemG的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述hemH的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体pRSFDuet-2的核苷酸序列如SEQIDNO.24所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体pCDFDuet-2的核苷酸序列如SEQIDNO.25所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体pACYCDuet-2的核苷酸序列如SEQIDNO.26所示。本专利技术的第二个目的是提供所述重组大肠杆菌的构建方法，步骤为：(1)以pUC19为表达载体，在大肠杆菌中过量表达hemA和hemL基因；(2)再以pRSFDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pACYCDuet-2为载体串联表达hemF、hemG和hemH基因；或以pCDFDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pRSFDuet-2或pACYCDuet-2为载体串联表达hemF、hemG和hemH基因；或以pACYCDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pRSFDuet-2或pCDFDuet-2为载体串联表达hemF、hemG和hemH基因；在本专利技术的一种实施方式中，所述方法步骤如下：(1)分别以pRSFDuet-2、pCDFDuet-2和pACYCDuet-2为载体，构建pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH六种重组载体；(2)将pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE和pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH组合，或将pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE和pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产血红素的重组大肠杆菌，其特征在于，串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并串联表达hemF、hemG和hemH基因。

【技术特征摘要】
1.一种高产血红素的重组大肠杆菌，其特征在于，串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并串联表达hemF、hemG和hemH基因。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，包括(a),(b)，(c)，其中(a)是以pRSFDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pACYCDuet-2为载体串联表达hemF、hemG和hemH基因；(b)是以pCDFDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pRSFDuet-2或pACYCDuet-2为载体，串联表达hemF、hemG和hemH基因；(c)是以pACYCDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pRSFDuet-2或pCDFDuet-2为载体，串联表达hemF、hemG和hemH基因；所述载体pRSFDuet-2的核苷酸序列如SEQIDNO.24所示；所述载体pCDFDuet-2的核苷酸序列如SEQIDNO.25所示；所述载体pACYCDuet-2的核苷酸序列如SEQIDNO.26所示。3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，还以pUC19为载体过量表达hemA和hemL基因。4.权利要求3所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，步骤为：(1)以pUC19为表达载体，在大肠杆菌中过量表达hemA和hemL基因；(2)再以pRSFDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pACYCDuet-2为载体串联表达hemF、hemG和hemH基因；或以pCDFDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pRSFDuet-2或pACYCDuet-2为载体串联表达hemF、hemG和hemH基因；或以pACYCDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pRSFDuet-2或pCDFDuet-2为载体串联表达hemF、hemG和hemH基因；所述载体pRSFDue...

【专利技术属性】
技术研发人员：康振，陈坚，堵国成，翁焕娇，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32