本发明专利技术涉及一种适用于制浆过程的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法。所述低产纤维素酶地衣芽孢杆菌，将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中的编码内切纤维素酶基因celB失活后获得；所述celB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术还涉及该低产纤维素酶地衣芽孢杆菌的构建方法。本发明专利技术构建的低产纤维素酶地衣芽孢杆菌菌株，既克服了纤维素酶过高表达引起纸浆纤维的破坏，同时一定程度低产的纤维素酶能够保障半纤维素酶和木质素酶纸浆处理效果的发挥，具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种适用于制浆过程的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法，属于生物工程
技术介绍
制浆造纸工业是国家支柱性产业之一，但传统的制浆造纸工业也是污染大户。造纸行业的污染主要是在制浆生产过程中产生，目前，传统的制浆方法主要采用化学制浆法，而化学制浆法在制浆过程中产生大量含残余木素和化学物质的废液，正是污染的罪魁祸首。因此，彻底解决制浆造纸工业的废水污染，研制开发无污染或低污染制浆造纸的技术已经迫在眉睫。现代制浆造纸工业的发展及其出现的一系列问题，使其与生物技术特别是微生物工程的联系日趋紧密。近十几年来，人们对生物技术在制浆造纸工业中的应用进行了大量的研究，其研究内容几乎涉及了制浆造纸工业的各个方面。生物制浆，其原理是利用具有木素降解能力的微生物(主要是白腐菌类)选择性地分解植物纤维原料中的木素。但由于木素不能做为碳源支持微生物的生长而需利用半纤维素和纤维素的分解以获得能量，因此选择无纤维素酶活的菌株就显得非常重要。同时,由于利用白腐菌处理原料的周期太长，难以满足大规模生产的要求，因而有的研究者倾向于“酶法制浆”。利用降解木素酶，在常温和常压条件下可使木片中木素去除率达到75％～80％，纸浆得率高达60％，从而降低纤维原料用量和废水污染负荷，松木和杨木木片都能用于生物制浆，尤其是阔叶材中木素通常易于被酶降解。但由于目前酶的价格昂贵，加上处理时间又长，要利用酶工程的纯生物制浆，尚难以短期内在工业生产上应用。地衣芽孢杆菌在自然界中分布广泛，较其它木质纤维素降解微生物具有繁殖快、适应性好、木质纤维素降解能力强等特点，在天然木质纤维素降解过程中也发挥重要的作用，但由于天然地衣芽孢杆菌具有较强的纤维素降解能力，因此直接应用在制浆过程中会损伤纤维素组分，降低纤维素回收率，地衣芽孢杆菌基因组中含有十种纤维素降解相关酶，完全敲除该菌纤维素酶基因难以操作，同时考虑到不同酶系之间存在协同降解作用，纤维素酶活性完全丧失会明显抑制该菌对半纤维素和木质素的降解效果。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种适用于制浆过程的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法。本专利技术技术方案如下：一种低产纤维素酶地衣芽孢杆菌，将地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)中的编码内切纤维素酶基因celB失活后获得；所述celB基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。根据本专利技术优选的，所述编码内切纤维素酶基因celB失活为通过基因敲除、基因增补、基因替换或基因突变引起编码内切纤维素酶基因celB的启动子、终止子或编码区的变化导致编码内切纤维素酶基因celB无法表达。上述低产纤维素酶地衣芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：(1)提取地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)20085菌体的DNA，以DNA为模板，使用引物F1和R1进行PCR扩增，得到用于celB基因敲除的同源臂celB1；所述的PCR引物序列如下：F1:CGGGATCCCGCTTCTAAAACACCCGTTGR1:AAGGCCAGCAAAAGTACATGACATTGCCGTCT(2)提取穿梭质粒PHT01的DNA，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到Cmr片段；所述的PCR引物序列如下：F2:ATGTCATGTACTTTTGCTGGCCTTTTGCTCAR2:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT(3)将步骤(i)制得的celB1片段与步骤(ii)制得的Cmr片段进行重叠PCR，制得celB1-Cmr片段；(4)将敲除载体用限制性内切酶BamHI酶切，并利用电转化仪转化至地衣芽孢杆菌感受态细胞，经复苏后，涂在含氯霉素的培养基上，在35～38℃培养1～2天，筛选具有氯霉素抗性的转化子，制得低产纤维素酶地衣芽孢杆菌。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC20085。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增体系如下：根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增体系如下：根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，重叠PCR的初次扩增体系为：所述的重叠PCR的补充扩增体系为：根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，重叠PCR的初次扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5个循环；72℃延伸2min；所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。根据本专利技术优选的，所述步骤(4)中，地衣芽孢杆菌感受态细胞的制备方法如下：挑取新鲜的Bacilluslicheniformis20085单菌落，培养至菌体浓度OD600为0.7～0.9，置于冰上冷却，冷却后离心，然后用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌体后分装至预冷的无菌的EP管，制得Bacilluslicheniformis20085电感受态细胞。根据本专利技术优选的，所述步骤(4)中，含氯霉素的培养基为含有氯霉素浓度为20～30μmol/mL的LB固体培养基。根据本专利技术优选的，所述步骤(4)中，电转化的条件为电压1500～2000V，电击时间4～5ms。根据本专利技术优选的，所述步骤(4)中，复苏为在35～38℃条件下于液体复苏培养基中培养3～4h，所述液体复苏培养基每升组分如下：蛋白胨8～10g，酵母浸粉3～5g，氯化钠8～10g，山梨醇85～100g，甘露醇60～800g，蒸馏水定容至1000mL。有益效果1、本专利技术构建的低产纤维素酶地衣芽孢杆菌菌株，既克服了纤维素酶过高表达引起纸浆纤维的破坏，同时一定程度低产的纤维素酶能够保障半纤维素酶和木质素酶纸浆处理效果的发挥，具有广泛的应用前景；2、本专利技术首次在菌株构建过程中选择性从十种纤维素酶中敲除编码内切纤维素酶基因celB，取得了通过传统发酵条件优化预料不到的技术效果——纤维素酶活性及纤维素水解能力显著下降，仅为原菌株的1/10左右，但半纤维素和木质素水解能力保留85％以上。附图说明图1为本专利技术的celB基因敲除转化子的琼脂糖凝胶电泳图；图中泳道M为DNA分子量标记(DNAmarker)，泳道1-4为转化子条带，大小为1834bp。图2为本专利技术构建的低产纤维素酶地衣芽孢杆菌菌株发酵能力的傅里叶红外光谱分析图；图中，830cm-1芳香核C-H、1235cm-1愈创木酚与C＝O伸缩振动、1593cm-1C-O伸缩振动、是木质素的特征吸收峰；2916cm-1木聚糖的C-H不对称伸缩振动，是半纤维素的特征吸收峰；3400cm-1为纤维素的特征吸收峰。具体实施方式本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种低产纤维素酶地衣芽孢杆菌，将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中的编码内切纤维素酶基因celB失活后获得；所述celB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种低产纤维素酶地衣芽孢杆菌，将地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)中的编码内切纤维素酶基因celB失活后获得；所述celB基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的低产纤维素酶地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述编码内切纤维素酶基因celB失活为通过基因敲除、基因增补、基因替换或基因突变引起编码内切纤维素酶基因celB的启动子、终止子或编码区的变化导致编码内切纤维素酶基因celB无法表达。3.权利要求1所述低产纤维素酶地衣芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)20085菌体的DNA，以DNA为模板，使用引物F1和R1进行PCR扩增，得到用于celB基因敲除的同源臂celB1；所述的PCR引物序列如下：F1:CGGGATCCCGCTTCTAAAACACCCGTTGR1:AAGGCCAGCAAAAGTACATGACATTGCCGTCT(2)提取穿梭质粒PHT01的DNA，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到Cmr片段；所述的PCR引物序列如下：F2:ATGTCATGTACTTTTGCTGGCCTTTTGCTCAR2:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT(3)将步骤(i)制得的celB1片段与步骤(ii)制得的Cmr片段进行重叠PCR，制得celB1-Cmr片段；(4)将敲除载体用限制性内切酶BamHI酶切，并利用电转化仪转化至地衣芽孢杆菌感受态细胞，经复苏后，涂在含氯霉素的培养基上，在35～38℃培养1～2天，筛选具有氯霉素抗性的转化子，制得低产纤维素酶地衣芽孢杆菌。4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC20085。5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增体系如下：优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增程序如下：95...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪俊卿，韩海红，王瑞明，王腾飞，肖静，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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