本发明专利技术公开了一株中等嗜热地衣芽孢杆菌及其在处理高温含油污水中的应用。本发明专利技术从中石化华东分公司泰州采油厂石油污染土壤中分离获得一株地衣芽孢杆菌属菌株，菌落直径为4-5mm，菌落形态呈圆形，边缘整齐，表面湿润光滑，浅黄色；油镜下菌体呈短杆状，革兰氏阳性菌，中生芽孢，无运动性；生长温度在40-60℃，最适生长温度50℃，V-P试验、番红染色均为阳性，产耐高温脂肪酶，发酵液可水解淀粉，产酸，16sDNA鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。本发明专利技术还公布了地衣芽孢杆菌菌株(Bacillus licheniformis)处理高温含油污水的应用。实验结果表明，本发明专利技术地衣芽孢杆菌菌株能高效降解石油烃类，应用于高温(45-60℃)含油污水的处理可降低能源浪费，同时可减少冷却过程中的芳香烃挥发带来的环境污染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于高温采油污水处理领域的微生物新技术，涉及一株产耐高温脂肪酶中等嗜热地衣芽孢杆菌及其在高温含油污水处理中的应用。
技术介绍
石油是我国最重要的能源之一，2014年我国石油产量高达2.1亿吨，在生产、生活中都发挥着十分重要的作用。然而石油开采过程中产生大量含石油烃的高温(约50℃)污水，如不能得到有效处理，将会对环境和人类健康造成巨大危害。微生物法具有处理成本低、操作简便、石油类污染物降解效果好、不易引起二次污染等特点而在采油污水处理领域得到广泛应用。浙江海洋学院选取油污处理厂长期受油污污染的土壤进行富集化培养，筛选得到对柴油石油烃具有分解作用的石油降解菌；中国海洋大学开展高效石油降解菌的筛选及其在油田废水深度处理中的应用，从石油污染的土壤和水体中富集、分离到12株高效石油降解菌，各单菌株的降油率为40.3％～57.6％，其中三种菌可耐受40℃的温度。沈阳大学从辽河油田和大庆油田污染土壤中分离出两株高效石油降解菌，分别为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。除油率分别为39％和48％。生长温度分别为25～35℃和28～40℃。但传统方法中用到的微生物多为嗜中温微生物，因此在处理高温采油污水时需要采用冷却塔先降温，然后再采用微生物处理。该方法存在能耗大、产生挥发性气体污染的问题。近年来，嗜热细菌引起了越来越多科学家的重视和兴趣。国内北京大学郝瑞霞教授早在2003年就开始降解石油烃嗜热细菌筛选。南开大学分子微生物学与技术教育部重点实验室也长期从事石油烃降解菌包括嗜热细菌的筛选及应用研究。南京农业大学沈标教授长期从事烷烃代谢和嗜热细菌的相关研究，分离获得MH-1等具有石油烃降解能力的嗜热细菌，并对其alkB基因的相关特性进行了研究，这些前期研究为嗜热细菌的驱油和污水处理应用奠定了良好基础。中国石油大学公开了嗜热菌在处理稠油污水方法中的应用，(a)将嗜热菌剂负载于填料上；(b)将稠油污水以及负载于所述填料上的嗜热菌剂共同置于反应单元中。查阅大量文献和专利书，发现未见耐热地衣芽孢杆菌在高温(45～60℃)含油废水处理中的应用。
技术实现思路
(1)本专利技术提供一株能应用于处理采油污水和石油污染的中等嗜热微生物菌株地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。(2)本专利技术将所述的微生物菌株可高效处理高温采油污水和石油污染，并具有产生耐高温脂肪酶的能力。本专利技术上述目的通过以下技术方案来实现：本专利技术提供了一株中等嗜热地衣芽孢杆菌，该菌是从中国石油化工集团公司华东分公司泰州采油厂石油污染的土壤中以原油为唯一碳源的情况下55℃反复驯化获得，命名为H43。H43的细胞形态特征如下：在LB上培养24h的菌落直径为4-5mm，菌落形态呈圆形，边缘整齐，表面湿润光滑，浅黄色；油镜下菌体呈短杆状；生长温度在40-60℃，最适生长温度50℃。pH为6～9，盐度0～4％。菌体大小为(0.7～0.9μm)×(2.0～3.0μm)，单个或短链排列，端生鞭毛，中生芽孢，革兰氏阳性菌。表1：地衣芽孢杆菌的生化特性注：“+”表示反应阳性“-”表示反应阴性参照《Bergey’sMannualofSyetematicBacteriology》的内容，根据形态特征、生理生化特征和16sDNA分子鉴定，H43为地衣芽孢杆菌属(Bacilluslicheniformis)。本专利技术H43菌株对55℃含1％原油的污水处理7d后石油烃的降解率达到46％；对泰州油田三相分离器出水口取得的高温含油污水(156mg/L石油烃含量)处理效率高达89.9％，同时产生脂肪酶。以上试验表明地衣芽孢杆菌属(Bacilluslicheniformis)H43在运用于高温含油废水的处理上效果明显，且在处理污水的同时产多种具有重要应用价值的生物工程产品。附图说明图1为本专利技术地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)H43的原子力显微镜图片(H43菌株原子力显微镜视图)；图2为本专利技术地衣芽孢杆菌的16srDNA鉴定序列(H43菌株经宝生物工程(大连)有限公司测序获得16srDNA基因序列)；图3为本专利技术地衣芽孢杆菌经NCBIBLAST之后得到的序列进化树(H43菌株经NCBIBLAST之后的系统进化树)；图4为本专利技术地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)H43的pH、温度、盐度的生长曲线(H43菌株在不同温度、pH和盐浓度的生长变化)；图5为本专利技术地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)H43作用前后原油气相色谱图，a为作用前，b为作用后(H43菌株作用前后原油气相色谱图)；图6为本专利技术地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)H43作用前后原油中正烷烃碳数的分布情况(H43菌株作用前后正构烷烃组分含)；图7为本专利技术地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)H43对各正构烷烃的降解率(H43菌株作用后不同正构烷烃的降解率)；图8为本专利技术地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)H43作用前后原油表面粘度与剪切速率的变化情况(H43菌株作用前后，原油粘度随剪切速率的变化)；具体实施方式实施例1：地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)H43菌株的筛选；1.取样：采用无菌容器从台南油田联合处理站采集原油(三相分离器出口管道，先流1min后再取样)和土壤(去除表层覆土0.5cm后取样)，随后放置在4℃保存备用。2.富集：分别取油污土壤样品，按5％比例接入装有100mL培养基(1mL微量元素溶液加10mL矿物盐溶液，加无菌水至100mL)的250mL三角锥形瓶中，摇床培养7d(55℃，160rpm)。取富集液5mL转接至相同新鲜培养基内，与相同条件下培养7d，如此连续富集培养7次。3.分离：配置LB固体培养基，经高压灭菌(121℃，20min)，取出放置超净台冷却到45℃～50℃时倒入灭菌后的90mm培养皿内(15mL)，待培养基冷却凝固后将培养基倒置搁放，24h后检查无菌污染方可使用。用接种环在LB固体培养基上划线，55℃培养(培养皿用封口膜密封，倒置培养)。24h后，选取不同的形态的菌，挑取单克隆于装有10mL的LB液体培养基中培养，摇床培养(55℃，160rpm)。4.所用培养基成分以上培养基经高压灭菌(121℃，20min)后置4℃保存备用。实施例2：地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)H43的形态和生理生化特征1.试验方法参照《Bergey’sMannualofSyetematicBacteriology》的实验方法进行，检测其革兰氏染色，菌体大小和形态、生长温度、生长pH范围、NaCl耐受性、淀粉水解、脂肪酶活性、V-P、甲基红、葡萄糖产酸实验。2.试验结本文档来自技高网...
【技术保护点】
本专利技术从石油烃污染土壤中分离获得一株耐热地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)可以高效降解石油烃。本专利技术还公布了地衣芽孢杆菌菌株处理高温含油污水的方法。
【技术特征摘要】
1.本发明从石油烃污染土壤中分离获得一株耐热地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)
可以高效降解石油烃。本发明还公布了地衣芽孢杆菌菌株处理高温含油污水的方法。
2.权利要求1利用地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)处理污水的温度范围为
45～60℃。
3.权利要求1利用地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)产耐高温脂肪酶。
4.权利要求1利...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗明志，闫筱，王悦，邓林红，陈皓，程旺林，姚红生，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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