一种利用地衣芽孢杆菌酶制剂去除黄曲霉毒素B1的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用地衣芽孢杆菌及其产生的酶去除黄曲霉毒素B1的方法。本发明专利技术通过发酵培养地衣芽孢杆菌BL010株获得的地衣芽孢杆菌BL010菌剂，以及通过超声波破碎地衣芽孢杆菌BL010细胞所获得的地衣芽孢杆菌BL010酶制剂均能够对生物材料中的AFB1进行高效降解。采用本发明专利技术的地衣芽孢杆菌BL010菌剂以及酶制剂可以达到快速、安全和高效生物降解去除生物材料中AFB1的目的。本发明专利技术方法对AFB1的降解条件温和，最适反应温度为30℃，不会对产品品质造成破坏。

Method for removing aflatoxin B1 by Bacillus licheniformis enzyme preparation

The invention relates to a method for removing aflatoxin B1 by Bacillus licheniformis and enzyme produced by Bacillus licheniformis. The present invention by fermentation of Bacillus licheniformis BL010 from Bacillus licheniformis BL010 fungi, and Bacillus licheniformis BL010 enzyme by ultrasonication of Bacillus licheniformis BL010 cells were obtained by efficiently degradation of biological materials in AFB1. The Bacillus licheniformis BL010 microbial agent and the enzyme preparation of the invention can achieve the purpose of fast, safe and efficient biological degradation of AFB1 in biological materials. The method of the invention has mild degradation condition for AFB1, and the optimum reaction temperature is 30 DEG C, and the product quality can not be damaged.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物
，涉及一种利用地衣芽孢杆菌及其产生的酶去除黄曲霉毒素B1的方法。
技术介绍
黄曲霉毒素具有强毒性、强致畸性和强致突变性，是危害最大的真菌毒素之一，不仅对粮食和饲料造成污染，而且严重危害人和动物的健康。在黄曲霉毒素中以黄曲霉毒素B1(AflatoxinB1，简称：AFB1)最为常见，危害性也最强，已经给相关行业带来巨大的经济损失。国家质检总局规定食品中AFB1为必检项目，中国食品卫生标准规定了几种主要易受污染食物中的最大允许量标准：玉米、花生、花生油≤20μg/kg；食用油为≤10μg/kg；其他粮食、豆类、发酵食品为≤5μg/kg。黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等多种真菌产生的次级代谢产物，其中包括多种衍生物，目前已分离鉴定出12种，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇，其中AFB1的致癌、致畸和致突变毒性最强。黄曲霉毒素的基本结构为二氢呋喃环和香豆素，B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)，分别与毒性和致癌性有关。黄曲霉毒素不仅抑制蛋白质的合成，而且干扰信息RNA和DNA的合成，导致动物全身性损害。黄曲霉毒素主要攻击靶位为肝脏，可导致肝炎、肝硬化、肝坏死和肝癌。黄曲霉毒素可溶于多种极性有机溶剂如氯仿、甲醇和乙醇中，但难溶于水，在光、热和酸性条件下稳定，当温度达到280℃以上才发生裂解。由于黄曲霉毒素结构稳定，传统的物理化学方法很难将其高效去除。与物化方法相比，生物降解具有成本低、条件相对温和不会对产品品质造成破坏等优点，因此是一种高效去除黄曲霉毒素的方法。AFB1具有环状结构，属于难生物降解的化合物，目前对其进行生物降解的研究并不多见。伊朗学者MohsenFarzaneh等从开心果中筛选出了一株枯草芽孢杆菌，在35-40℃条件下24h内对开心果中AFB1的降解去除率高达95％，其粗酶的降解效率为78.4％。中国学者曹洪等从假蜜环菌多酶复合体中成功分离纯化出一种新的黄曲霉毒素降解酶，能够催化断裂二氢呋喃环。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种能够高效生物降解AFB1的细菌菌株，可以快速高效生物降解去除生物质材料中的AFB1。本专利技术的目的之二是提供一种上述菌株的培养方法，利用此方法对上述菌株进行发酵培养，所获得的培养物具有较高的光密度和细胞菌落形成单位(CFU)。本专利技术的目的之三是提供一种利用上述菌株有效去除黄曲霉毒素B1的方法。一种地衣芽孢杆菌菌株，名称为地衣芽孢杆菌BL010株(Bacilluslicheniformis,StrainBL010)，保藏编号为：CGMCCNO.12898，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏日期：2016年8月24日。所述菌株的特征在于能够高效生物降解黄曲霉毒素B1(AFB1)。一种地衣芽孢杆菌酶制剂的制备方法，具体制备步骤为：步骤A，提取地衣芽孢杆菌BL010株，保藏编号为：CGMCCNO.12898，菌株能够生物降解黄曲霉毒素B1；所述的地衣芽孢杆菌菌株的16SrDNA的同源性至少为90％的菌株；步骤B，将发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵培养，获得发酵培养物；发酵菌种由相应的菌株经过种子培养获得；步骤C，对发酵培养物进行离心分离处理，获得地衣芽孢杆菌湿菌体，地衣芽孢杆菌湿菌体再经过重悬、细胞破碎处理和离心分离处理获得酶制剂。步骤B所述发酵培养物的光密度(OD680nm)≥40；所述发酵培养物的细胞菌落形成单位(CFU)≥100亿/mL，优选步骤A所述的地衣芽孢杆菌菌株的16SrDNA的同源性至少为95％的菌株。进一步的所述发酵培养基以1L水计，包括在1L水中的以下组分：进一步的所述发酵培养基的pH值为6.5-8.0，优选发酵培养基的pH值为6.5-7.2。一种利用地衣芽孢杆菌酶制剂去除黄曲霉毒素B1的方法，将制得的酶制剂与含有黄曲霉毒素B1的生物质材料混合后生物降解去除生物质材料中的黄曲霉毒素B1；其中所述生物质材料包括饲料和粮食。进一步的所述生物材料中黄曲霉毒素B1的含量为20μg/kg-20mg/kg；生物材料中水的质量含量为1％-20％，优选生物材料中水的质量含量为16.7％-20％。进一步的所述生物降解的温度为20-35℃，基于生物质材料总重量计，所述菌剂的用量为0.1wt％-1wt％，酶制剂的用量为0.5v％-5v％。优选生物降解的温度为25-30℃；基于生物质材料总重量计，所述菌剂的用量为0.2wt％-0.5wt％；所述酶制剂的用量为0.5v％-2v％；所述酶制剂的蛋白浓度为400-500mg/L。采用本专利技术的地衣芽孢杆菌BL010菌剂以及酶制剂可以达到快速、安全和高效生物降解去除生物材料中AFB1的目的。本专利技术方法对AFB1的降解条件温和，最适反应温度为30℃，不会对产品品质造成破坏。附图说明下面将结合附图来说明本专利技术。图1为地衣芽孢杆菌BL010基于16SrDNA的分子进化树。图2为地衣芽孢杆菌BL010优化培养生长曲线。图3为地衣芽孢杆菌BL010生物降解玉米中AFB1的动力学过程图。图4为地衣芽孢杆菌BL010粗酶生物降解玉米中AFB1的动力学过程图。具体实施方式为使本专利技术容易理解，下面将详细说明本专利技术。为寻求安全高效去除黄曲霉毒素B1的新途径，本专利技术人经过不懈的研究探索，终于从长期遭受黄曲霉毒素污染的玉米中成功筛选出了一株具备生物降解AFB1能力的微生物菌种，经分离鉴定为地衣芽孢杆菌BL010(BacilluslicheniformisstrainBL010)，检测结果表明，该菌株对AFB1具有较高的生物降解能力；进一步研究发现，细胞破碎后获得的粗酶具备更高的生物降解AFB1活性，这些发现为进一步高效去除粮食和饲料中AFB1的应用奠定了良好基础。本专利技术正是基于上述发现作出的。因此，本专利技术第一方面所涉及的地衣芽孢杆菌菌株能够高效、快速地生物降解黄曲霉毒素B1，其采用以下筛选培养基进行筛选和培养获得，该培养基的组成如下(1000mL去离子水中)：本专利技术筛选用于生物降解AFB1的地衣芽孢杆菌菌株的方法包括以下步骤：(1)按照上述培养基组成配制培养基，并采用氢氧化钠和盐酸溶液调整上述培养基的初始pH至7.0。在50ml三角瓶中加入0.5ml的200mg/L的AFB1乙醇标准原液，采用吹风机吹干乙醇后，加入5.0ml无机培养基配制成以AFB1为唯一有机碳源的筛选培养基。经高温(121℃)高压(0.15MPa)下灭菌20min，然后在洁净工作台内紫外线照射灭菌20min后使用。在液体培养基中加入1.5％(重量/体积)的琼脂，经过高温高压灭菌溶解后倒入到培养皿中冷却，可以制备出对应的固体培养基平板。(2)称取10g污染了AFB1的玉米粉样品加入到100ml经灭菌的生理盐水中，充分震荡30min后静置2h。在超净工作台内取上清液100μL接种到筛选培养基中，在温度30℃、摇床转速200r/min下摇床培养3d后，取样100μL再重新接种于筛选培养基中培养。重复培养3次后，采用灭菌后的生理食盐水将培养物分别稀释到10-3、10-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种地衣芽孢杆菌酶制剂的制备方法，其特征在于，具体制备步骤为：步骤A，提取地衣芽孢杆菌BL010株，保藏编号为：CGMCC NO.12898，菌株能够生物降解黄曲霉毒素B1；所述的地衣芽孢杆菌菌株的16S rDNA的同源性至少为90％的菌株；步骤B，将发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵培养，获得发酵培养物；发酵菌种由相应的菌株经过种子培养获得；步骤C，对发酵培养物进行离心分离处理，获得地衣芽孢杆菌湿菌体，地衣芽孢杆菌湿菌体再经过重悬、细胞破碎处理和离心分离处理获得酶制剂。

【技术特征摘要】
1.一种地衣芽孢杆菌酶制剂的制备方法，其特征在于，具体制备步骤为：步骤A，提取地衣芽孢杆菌BL010株，保藏编号为：CGMCCNO.12898，菌株能够生物降解黄曲霉毒素B1；所述的地衣芽孢杆菌菌株的16SrDNA的同源性至少为90％的菌株；步骤B，将发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵培养，获得发酵培养物；发酵菌种由相应的菌株经过种子培养获得；步骤C，对发酵培养物进行离心分离处理，获得地衣芽孢杆菌湿菌体，地衣芽孢杆菌湿菌体再经过重悬、细胞破碎处理和离心分离处理获得酶制剂。2.根据权利要求1所述一种地衣芽孢杆菌酶制剂的制备方法，其特征在于，步骤B所述发酵培养物的光密度(OD680nm)≥40；所述发酵培养物的细胞菌落形成单位(CFU)≥100亿/mL。3.一种用于去除生物质材料中的黄曲霉毒素B1的菌剂，其特征在于：步骤A所述的地衣芽孢杆菌菌株的16SrDNA的同源性至少为95％的菌株。4.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌酶制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基以1L水计，包括在1L水中的以下组分：所述发酵培养基的pH值为6.5-8.0。5.根据权利要求4所述的一种地衣芽孢杆菌酶制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓璐，许倩倩，吕乐，闫海，丁涛，尹春华，张海洋，
申请(专利权)人：北京科技大学，
类型：发明
国别省市：北京;11