一种地衣芽孢杆菌的提纯方法技术

本发明专利技术公开了一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，包括如下步骤：(1)取地衣芽孢杆菌菌种，接种，制成均匀菌悬液，5‑7℃保存备用；(2)将第一培养基加入二号三角瓶中，摇床培养，得到菌种；(3)取第二培养基，并将培养基中加入蒸馏水，在电炉上煮沸5‑10min，冷却到室温，凝固待用；(4)第二培养基融化，并涂布于平板上，再将菌种在平板上进行划线培养，将地衣芽孢杆菌进行分离、纯化；(5)将分离、纯化得到的地衣芽孢杆菌进行培育。本发明专利技术对市售的地衣芽孢杆菌菌种进行培养、扩大，适应之后，进行进一步的分离纯化，提高了纯化的成功率，使得纯化的地衣芽孢杆菌菌种充分表现出其较佳的生长性能。

Method for purifying Bacillus licheniformis

The invention discloses a method for purifying Bacillus licheniformis, which comprises the following steps: (1) from Bacillus subtilis strain, inoculated into uniform bacterial suspension, 5 7 C preservation reserve; (2) the first medium with two triangle flask, shaking culture, strains (3) were obtained; second medium, and the culture medium added with distilled water, boil for 5 10min in electric furnace, cooling to room temperature and solidification for use; (4) second medium melt, and coated on the plate, and then strain streak on the plate, the Bacillus licheniformis in separation and purification; (5) will be isolated and purified from Bacillus licheniformis were bred. After the invention of cultivation, expansion of Bacillus licheniformis strains commercially available to adapt, to further purify and improve the success rate of the purification, purification of Bacillus subtilis strain shows its better growth performance.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物
，具体为一种地衣芽孢杆菌的提纯方法。
技术介绍
芽孢杆菌属(BacillusCohn,1872)，细胞呈直杆状，0.5～2.5μm×1.2～10μm，常以成对或链状排列，具圆端或方端。细胞染色大多数在幼龄培养时呈现革兰氏阳性，以周生鞭毛运动。芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，能抗许多不良环境。每个细胞产一个芽孢，生孢不被氧所抑制；好氧或兼性厌氧，具有对热、pH和盐等不同环境的耐受性。它属于化能异养菌，具发酵或呼吸代谢类型，通常接触酶阳性。芽孢杆菌属发现于不同的环境，少数种对脊椎动物和非脊椎动物致病。芽孢杆菌属是一群好氧和兼性厌氧生活，产耐热性内生孢子的杆状细菌。它的营养细胞具有活跃的酶活性和多样的代谢类型，从而被广泛应用于生产各种酶制剂、杀虫剂、抗生素和生物添加剂等。它还具有处于休眠期的内生孢子和营养细胞交替的生长周期，可作为研究细菌分化的重要材料，而作为典型种的枯草芽孢杆菌又是分子生物学研究的重要材料之一。芽孢杆菌属中存在很多特殊功能的菌株，在工业、农业、医学、军事和科学研究中都有广泛的应用价值。有的可以在高渗、高酸、高碱、高温、高寒的环境下良好生长，有较大的生态学价值；有的可分泌多种酶类，应用于酶制剂工业；有的可作为多种蛋白基因表达受体，在基因工程和生物学研究领域中有较高的应用价值；除极个别的菌种外，多数菌种与动物，植物关系密切并与其形成良好的共生体系，可以将其应用于益生菌制剂，微生物肥料的生产；有的菌种能产生对昆虫毒性较强的蛋白，用于微生物农药的生产；炭疽芽孢杆菌用于生物武器显示其重要的军事意义。但是，目前并没有一种合理的方法实现地衣芽孢杆菌的提纯，导致微生物菌的纯度很低，影响了后续的使用。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题在于提供一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，从而解决上述
技术介绍
中的问题。本专利技术所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，包括如下步骤：(1)取地衣芽孢杆菌菌种，接种至新鲜试管斜面，于31-35℃培养19-25h，然后取培养好的斜面，加入10-15mL无菌生理盐水，用接种环将斜面上的菌苔轻轻刮下，振荡无菌生理盐水，然后将无菌生理盐水倾注于另一盛有30-35mL无菌生理盐水的一号三角瓶中，瓶中放入四粒营养珠，然后在摇床上以100-130r/min的速度振荡25-27min，制成均匀菌悬液，5-7℃保存备用；(2)取第一培养基，并将培养基加入二号三角瓶中，加塞后，0.1-0.3MP灭菌23-27min，然后将步骤(1)得到的均匀菌悬液接种到二号三角瓶的培养基中，接种量按3-4％(V/V)(菌悬液与培养基的体积比)，接种后将二号三角瓶于35-37℃，振荡28-35h，摇床转速为120-145r/min，得到菌种；(3)取第二培养基，并将培养基中加入蒸馏水，在电炉上煮沸5-10min，冷却到室温，凝固待用；(4)将步骤(3)得到的第二培养基融化，并涂布于平板上，再将步骤(2)得到的菌种在平板上进行划线培养，将地衣芽孢杆菌进行分离、纯化；(5)将分离、纯化得到的地衣芽孢杆菌进行培育。本专利技术中，作为一种优选的技术方案，所述营养珠包括以下重量份的原料制备而成：胰蛋白胨1-1.5、酵母浸出粉0.7-0.9、NaCl1.2-1.3；pH为7.3。本专利技术中，作为一种优选的技术方案，所述第一培养基包括以下重量份的原料制备而成：蛋白胨5-7，牛肉膏4-5，NaCl5-7。本专利技术中，作为一种优选的技术方案，所述第二培养基包括以下重量份的原料制备而成：葡萄糖2.5-2.7、豆芽浸汁25-27、酵母浸粉0.8-1.2；pH7.0。本专利技术中，作为一种优选的技术方案，所述步骤(4)的划线培养，其步骤如下：A.融化培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化。B.倒平板：待培养基冷却至50℃左右，按无菌操作法倒2只平板(每皿约15m1)，平置，待凝固。倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约15m1，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。C.作分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D四个面积不等的区域。各区之间的交角应为120℃左右(平板转动一定角度约60℃)，以便充分利用整个平板的面积，而且采用这种分区法可使D区与A区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。D.划线操作(1)挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。(2)划A区：将平板倒置于煤气(酒精)灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯(这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定)。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。(3)划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区(菌源区)将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。E.恒温培养：将划线平板倒置，于37℃(或28℃)培养，24h后观察。F.取生长态势最为优秀的菌落，作为纯化后的菌种，进行后续的培育。本专利技术中，作为一种优选的技术方案，所述步骤(5)的培育方法，其步骤如下：采用300L不锈钢发酵罐，高径比为2.3：1.4，装液量73-78％，培养周期90h，将步骤(4)得到的纯化菌种进行摇瓶培养，然后接种，接种量7-9％，温度30～34℃，罐压0.13-0.17MPa，搅拌转速100-120r/min。其中，摇瓶培养时，摇瓶内培养基包括玉米粉3-5重量份，豆饼粉4-6重量份，营养盐适量，pH6.6～6.8。由于采用了以上技术方案，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术通过对市售的地衣芽孢杆菌菌种进行培养、扩大，适应之后，进行进一步的分离纯化，提高了纯化的成功率，使得纯化的地衣芽孢杆菌菌种充分表现出其较佳的生长性能，经过本专利技术纯化后的地衣芽孢杆菌菌种，在进行步骤(5)的扩大培育后，检测营养液内含活菌量(地衣芽孢杆菌)达到3.5×1010CFU/mL。具体实施方式为了使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。实施例1一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，包括如下步骤：(1)取地衣芽孢杆菌菌种，接种至新鲜试管斜面，于31℃培养19h，然后取培养好的斜面，加入10mL无菌生理盐水，用接种环将斜面上的菌苔轻轻刮下，振荡无菌生理盐水，然后将无菌生理盐水本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)取地衣芽孢杆菌菌种，接种至新鲜试管斜面，于31‑35℃培养19‑25h，然后取培养好的斜面，加入10‑15m L无菌生理盐水，用接种环将斜面上的菌苔轻轻刮下，振荡无菌生理盐水，然后将无菌生理盐水倾注于另一盛有30‑35m L无菌生理盐水的一号三角瓶中，瓶中放入四粒营养珠，然后在摇床上以100‑130r/min的速度振荡25‑27min，制成均匀菌悬液，5‑7℃保存备用；(2)取第一培养基，并将培养基加入二号三角瓶中，加塞后，0.1‑0.3MP灭菌23‑27min，然后将步骤(1)得到的均匀菌悬液接种到二号三角瓶的培养基中，接种量按3‑4％，接种后将二号三角瓶于35‑37℃，振荡28‑35h，摇床转速为120‑145r/min，得到菌种；(3)取第二培养基，并将培养基中加入蒸馏水，在电炉上煮沸5‑10min，冷却到室温，凝固待用；(4)将步骤(3)得到的第二培养基融化，并涂布于平板上，再将步骤(2)得到的菌种在平板上进行划线培养，将地衣芽孢杆菌进行分离、纯化；(5)将分离、纯化得到的地衣芽孢杆菌进行培育。

【技术特征摘要】
1.一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)取地衣芽孢杆菌菌种，接种至新鲜试管斜面，于31-35℃培养19-25h，然后取培养好的斜面，加入10-15mL无菌生理盐水，用接种环将斜面上的菌苔轻轻刮下，振荡无菌生理盐水，然后将无菌生理盐水倾注于另一盛有30-35mL无菌生理盐水的一号三角瓶中，瓶中放入四粒营养珠，然后在摇床上以100-130r/min的速度振荡25-27min，制成均匀菌悬液，5-7℃保存备用；(2)取第一培养基，并将培养基加入二号三角瓶中，加塞后，0.1-0.3MP灭菌23-27min，然后将步骤(1)得到的均匀菌悬液接种到二号三角瓶的培养基中，接种量按3-4％，接种后将二号三角瓶于35-37℃，振荡28-35h，摇床转速为120-145r/min，得到菌种；(3)取第二培养基，并将培养基中加入蒸馏水，在电炉上煮沸5-10min，冷却到室温，凝固待用；(4)将步骤(3)得到的第二培养基融化，并涂布于平板上，再将步骤(2)得到的菌种在平板上进行划线培养，将地衣芽孢杆菌进行分离、...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘亚民，
申请(专利权)人：山东中创亿丰肥料集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37