一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌及其构建方法和应用，本发明专利技术通过基因工程的方法对地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA序列中的

【技术实现步骤摘要】
一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌及其构建方法和应用
本专利技术涉及微生物基因工程领域，尤其是一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌及其构建方法和应用。
技术介绍
杆菌肽为淡黄色或类白色粉末，是由10种氨基酸、12个氨基酸残基构成的多肽类抗生素，可有效抑制革兰氏阳性病原菌和部分革兰氏阴性菌，被广泛添加于饲料中。目前，杆菌肽通过微生物发酵法生产，主要生产菌株为地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)。杆菌肽发酵过程中具有强烈的臭味，严重影响环境，且异味物质附着在杆菌肽产品表面，影响产品质量。鉴于现有的大多数地衣芽胞杆菌生产杆菌肽的产量均较低，不利于投入工业化生产，因此，现有的关于杆菌肽的研究都集中在提高杆菌肽产量以追求经济效益的最大化，而并未见到关于解决如何去除杆菌肽发酵生产中臭味的相关研究。在微生物发酵过程中，通常采用的除臭方式为：采用除臭剂对发酵过程中的臭味气体进行吸附去除。但是，这种除臭方式不仅需要大量的除臭剂，增加了投入成本，并且，除臭剂需要放置于发酵罐内，容易造成发酵液染菌，造成重大经济损失。随着人们对环境安全和产品品质的日益关注，杆菌肽发酵异味问题亟待解决。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌及其构建方法，将此菌株应用在杆菌肽生产中，可实现高产杆菌肽的同时显著减小发酵异味的目的。一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌的构建方法，包括以下步骤：1)根据地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)DW2基因组DNA序列中的ptb基因的上、下游序列，设计ptb基因的上、下游同源臂引物；并以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，分别以ptb基因的上、下游同源臂引物进行PCR扩增得到ptb基因的上游同源臂和ptb基因的下游同源臂，再利用重叠延伸PCR方法将ptb基因的上游同源臂和ptb基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；2)采用限制性内切酶XbaⅠ和BamHI对步骤(1)得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；同时，采用限制性内切酶XbaⅠ和BamHI对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori，并将酶切基因序列A连接到酶切质粒T2(2)-ori中，得到ptb基因敲除质粒T2(2)-ori-ptb；3)通过电转化将步骤2)得到的ptb基因敲除质粒T2(2)-ori-ptb转入地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到ptb基因的上游臂或ptb基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；4)挑选ptb基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与ptb基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除ptb基因的地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)DW2△ptb；其中，步骤(1)和步骤(3)中所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2011344；所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的ptb基因为SEQUENCELISTING中所示。基于本专利技术人已开发出杆菌肽生产水平已完全能够满足工业化生产、且达到行业领先水平的地衣芽胞杆菌DW2菌株，并且，考虑到人们对环境安全和产品品质日益关注以及企业对杆菌肽市场占有率的更高要求，本专利技术人就如何解决杆菌肽生产中臭味问题以提高杆菌肽品质和环境问题作为出发点提出了本专利技术的技术方案。并且，本专利技术的技术方案是通过基因工程手段改造杆菌肽生产菌株来解决杆菌肽生产中异味问题的，突破了本领域技术人员在解决除臭问题方面的常规思维；并且，本专利技术通过对高产杆菌肽的地衣芽胞杆菌DW2菌株进行基因敲除来构建工程菌，得到的地衣芽胞杆菌DW2△ptb在保证依然具有高产杆菌肽目的的前提下，在杆菌肽发酵过程中主要臭味物质-支链短链脂肪酸(简称BCFAs，包括异戊酸、异丁酸等)的合成量明显降低，例如：异丁酸、异戊酸等的合成量分别降低33％、37％，异味显著减少，具有重要的应用价值。本申请的构建方法得到的菌株之所以能够降低异丁酸、异戊酸等的合成量，其原因可能在于：所述的地衣芽胞杆菌DW2中的ptb基因为磷酸丁酰转移酶的编码基因，而磷酸丁酰转移酶又是BCFAs形成的限速酶，因此，地衣芽胞杆菌DW2中的ptb基因的敲除，限制了BCFAs的合成，从而，使得异丁酸、异戊酸等的合成量显著降低。本专利技术另一目的在于提供一种根据上述低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2△ptb。其中，根据上述低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的一株地衣芽胞杆菌DW2△ptb，其保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M2016598，保藏日期为2016年10月28日。本专利技术的目的之三在于将上述低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的敲除ptb基因的地衣芽胞杆菌DW2△ptb应用于抗菌肽生产中。附图说明图1为步骤2)得到的ptb基因敲除质粒T2(2)-ori-ptb双酶切验证结果琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为未酶切的质粒T2(2)-ori；泳道2为ptb基因敲除已敲除ptb基因的质粒T2(2)-ori-ptb；泳道3为双酶切T2(2)-ori-ptbT2-ptb的条带；泳道M为DNAmarker(从上到下的条带对应的分子量依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。图2为地衣芽胞杆菌工程菌DW2Δptb菌落PCR验证图，其中，泳道M为DNAmarker(从上到下的条带对应的分子量依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道1为以地衣芽胞杆菌DW2为模板，用验证引物ptbYZ-F、ptbYZ-R进行菌落验证的条带；泳道2为以地衣芽胞杆菌DW2Δptb为模板，用验证引物ptbYZ-F、ptbYZ-R进行菌落验证的条带。具体实施方式一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌的构建方法，包括以下步骤：1)根据地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)DW2基因组DNA序列中的ptb基因的上、下游序列，设计ptb基因的上、下游同源臂引物；并以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，分别以ptb基因的上、下游同源臂引物进行PCR扩增得到ptb基因的上游同源臂(通常为450-550bp)和ptb基因的下游同源臂(通常为450-550bp)，再利用重叠延伸PCR方法将ptb基因的上游同源臂和ptb基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；2)采用限制性内切酶XbaⅠ和BamHI对步骤(1)得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；同时，采用限制性内切酶XbaⅠ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌的构建方法，包括以下步骤：1）根据地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA序列中的

【技术特征摘要】
1.一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌的构建方法，包括以下步骤：1）根据地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA序列中的ptb基因的上、下游序列，设计ptb基因的上、下游同源臂引物；并以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，分别以ptb基因的上、下游同源臂引物进行PCR扩增得到ptb基因的上游同源臂和ptb基因的下游同源臂，再利用重叠延伸PCR方法将ptb基因的上游同源臂和ptb基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；2）采用限制性内切酶XbaⅠ和BamHI对步骤（1）得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；同时，采用限制性内切酶XbaⅠ和BamHI对质粒T2（2）-ori进行双酶切，得到酶切质粒T2（2）-ori，并将酶切基因序列A连接到酶切质粒T2（2）-ori中，得到ptb基因敲除质粒T2（2）-ori-ptb；3）通过电转化将步骤2）得到的ptb基因敲除质粒T2（2）-ori-ptb转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到ptb基因的上游臂或ptb基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，魏雪团，陈杨阳，李俊辉，段茂华，楼丽君，陈晓斌，
申请(专利权)人：绿康生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35