生产β-胡萝卜素的重组微生物及构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了MEP途径限速步骤发现、解除及其在萜烯类化合物生产中的应用。本发明专利技术提供了一种构建重组菌的方法，为提高产β‑胡萝卜素大肠杆菌中(E)‑4‑羟基‑3‑甲基‑2‑丁烯基‑焦磷酸合成酶基因ispG和(E)‑4‑羟基‑3‑甲基‑2‑丁烯基‑焦磷酸还原酶基因ispH的表达和/或活性，得到重组菌。本发明专利技术的实验证明，在具有一定β‑胡萝卜素合成能力的重组大肠杆菌中，MEP途径中间体HMBPP胞内积累，可以引起细胞毒性；协调表达ispG和ispH基因，可以有效提高重组大肠杆菌的萜烯类化合物合成能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及MEP途径限速步骤发现、解除及其在萜烯类化合物生产中的应用，尤其涉及生产β-胡萝卜素的重组微生物及构建方法与应用。
技术介绍
萜类化合物(terpenoids)是自然界中存在的一类由异戊二烯为结构单元组成的化合物。许多萜类化合物具有很好的药理活性，是中药和天然植物药的主要有效成分。有些萜类化合物已经开发出临床广泛应用的有效药物。β-胡萝卜素和番茄红素是两种典型的萜类化合物。β-胡萝卜素是具有抗氧化、解毒、抗癌、预防心血管疾病，防治白内障和保护肝脏等作用。此外，β-胡萝卜素有维生素A源之称，是一种重要的人体生理功能活性物质，可以治疗由于缺乏维生素A引起的上体细胞质角质化，干眼病、夜盲症等(Leeetal.,2002；Dasetal.,2007)。世界上已有52个国家地区批准使用。由于萜类化合物具有广泛的应用前景，市场需求巨大，因此高效生产萜类化合物的方法一直以来是研究热点。目前萜类化合物的生产方法主要有三种：化学合成法、植物提取法和微生物发酵法。化学合成法工艺流程复杂、能耗高、污染大；另一方面，萜类化合物在植物中的含量通常很低，植物提取法对野生植物资源造成严重破坏；相比之下，微生物发酵法不受原料的限制、生产过程绿色清洁，具有很大的优势。由于大肠杆菌(Escherichiacoli)基因组序列已完全公布，遗传背景和代谢途径都非常清楚、具有培养基要求简单和生长迅速等优点，很多研究都选取大肠杆菌作为出发菌种进行改造生产萜类化合物。图1为引入萜烯类合成基因后大肠杆菌生成萜烯类化合物的合成途径。异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯基焦磷酸(Dimethylallylpyrophosphate，DMAPP)是所有萜类化合物的前体化合物，目前已知有两种合成途径(Leeetal.,2002)。一种是甲羟戊酸途径(MevalonicAcidPathway，MVA途径)，主要存在于真菌和植物的胞液或内质网上。另一种是MEP途径，主要存在于细菌、绿藻和植物质体中。该途径的起始物是3-磷酸甘油醛和丙酮酸，经一系列酶催化形成大约5:1的IPP和DMAPP混合物。IPP在异戊酰焦磷酸异构酶(Isopentenyldiphosphateisomerase,Idi)的催化下异构成二甲基丙烯基焦磷酸DMAPP。IPP与DMAPP是萜类化合物的基本C5单位，可以在此基础上合成各种萜类化合物。大肠杆菌具有MEP途径，可以合成萜类化合物的前体物质IPP与DMAPP，将萜类化合物的合成基因引入大肠杆菌，大肠杆菌即可生产萜类化合物。但由于大肠杆菌合成IPP和DMAPP的能力很差，所以萜类化合物的产量通常很低。提高大肠杆菌中MEP途径的代谢流、提高合成IPP与DMAPP的能力，成为提高大肠杆菌合成萜烯类化合物产量的关键。多个研究小组在寻找MEP途径中限速步骤、提高MEP途径中关键基因的表达强度中，做了大量工作(Yoonetal.,2007；Ajikumaretal.,2010；Alperetal.,2005a；Alperetal.,2005b；Choietal.,2010；JinandStephanopoulos,2007；Yuanetal.,2006)。研究表明提高MEP途径中1-脱氧-木酮糖-5-磷酸合成酶基因(dxs)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D赤藓糖醇合成酶基因(ispD)和4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D赤藓糖醇激酶基因(ispF)、2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶基因(ispE)、异戊酰焦磷酸异构酶基因(idi)的表达强度能提高重组大肠杆菌生产β-胡萝卜素的能力。但提高MEP途径中1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因(dxr)、(E)-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸合成酶基因(ispG)、(E)-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸还原酶基因(ispH)的表达强度反而降低了重组大肠杆菌生产β-胡萝卜素的能力(Yuanetal.,2006)。为了鉴定MEP途经的限速步骤，Yuan等利用同源重组的方法，用T5启动子在染色体上分别替换了MEP途径的各基因的启动子，发现调控dxs、idi、ispB、ispDF基因后，β-胡萝卜素产量分别提高了100％、40％、20％和40％。用T5启动子对这4个基因进行组合调控后，β-胡萝卜素产量提高了6.3倍，达到6mg/g干重细胞(Yuanetal.,2006)。Suh用强启动子T5调控MEP途经的关键基因dxs、idi和ispDF后，β-胡萝卜素产量比对照提高了4.5倍(Suhetal.,2012)。除了已经鉴定的MEP途径中的限速步骤外，可能MEP途径中还有其他蛋白因为高表达时可溶性低，而没有发现限速(Zhouetal.,2012)。Zhao2013研究发现，在前体物质供给不足时，下游β-胡萝卜素合成基因很难完成高强度启动子调控实验，而当前体物质供应充足时，很容易实现高强度启动子调控下游基因，因此认为，菌株条件改变，大肠杆菌产β-胡萝卜素的限速步骤会跟着改变(Zhaoetal.,2013)。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种重组菌。本专利技术提供的重组菌，为提高产β-胡萝卜素大肠杆菌中(E)-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸合成酶基因ispG和(E)-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸还原酶基因ispH的表达和/或活性，得到重组菌。上述重组菌中，所述提高产β-胡萝卜素大肠杆菌中ispG和ispH基因的表达和/或活性为通过同时调控产β-胡萝卜素大肠杆菌中ispG基因和ispH基因的启动子实现的。上述重组菌中，所述同时调控产β-胡萝卜素大肠杆菌中ispG基因和ispH基因的启动子为如下1)-9)中任一种：1)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列23所示的调控元件mRSL-4::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列32所示的mRSL-14::ispH；2)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列21所示的mRSL调控元件mRSL-1::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列29所示的mRSL-3::ispH；3)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列21所示的mRSL调控元件mRSL-1::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列30所示的mRSL-4::ispH；4)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列21所示的mRSL调控元件mRSL-1::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列32所示的mRSL-14::ispH；5)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列23所示的mRSL调控元件mRSL-4::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列29所示的mRSL-3::ispH；6)将所本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组菌，为提高产β‑胡萝卜素大肠杆菌中(E)‑4‑羟基‑3‑甲基‑2‑丁烯基‑焦磷酸合成酶基因ispG和(E)‑4‑羟基‑3‑甲基‑2‑丁烯基‑焦磷酸还原酶基因ispH的表达和/或活性，得到重组菌。

【技术特征摘要】
1.重组菌，为提高产β-胡萝卜素大肠杆菌中(E)-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸合成酶基因ispG和(E)-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸还原酶基因ispH的表达和/或活性，得到重组菌。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述提高产β-胡萝卜素大肠杆菌中ispG和ispH基因的表达和/或活性为通过同时调控产β-胡萝卜素大肠杆菌中ispG基因和ispH基因的启动子实现的。3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于：所述同时调控产β-胡萝卜素大肠杆菌中ispG基因和ispH基因的启动子为如下1)-9)中任一种：1)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列23所示的调控元件mRSL-4::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列32所示的mRSL-14::ispH；2)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列21所示的mRSL调控元件mRSL-1::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列29所示的mRSL-3::ispH；3)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列21所示的mRSL调控元件mRSL-1::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列30所示的mRSL-4::ispH；4)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列21所示的mRSL调控元件mRSL-1::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列32所示的mRSL-14::ispH；5)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列23所示的mRSL调控元件mRSL-4::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列29所示的mRSL-3::ispH；6)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列23所示的mRSL调控元件mRSL-4::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列30所示的mRSL-4::ispH；7)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列25所示的mRSL调控元件mRSL-11::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列29所示的mRSL-3::ispH；8)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列25所示的mRSL调控元件mRSL-11::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列30所示的mRSL-4::ispH；9)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列25所示的mRSL调控元件mRSL-11::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列32所示的mRSL-14::ispH。4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于：所述插入是采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；或所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑；或所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组。5.根据权利要求1-4中任一所述的重组菌，其特征在于：所述产β...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学礼，李清艳，唐金磊，毕昌昊，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12