重组菌株及其构建方法、应用技术

本发明专利技术涉及微生物领域，特别涉及重组菌株及其构建方法、应用。本发明专利技术保护将目标基因以重组质粒或插入染色体等方式导入棒杆菌或短杆菌得到的工程菌株。摇瓶发酵生产L-缬氨酸实验结果表明：出发菌株CGMCC 1.299的L-缬氨酸产量为3.2g/L，而本发明专利技术的工程菌MHZ-1011的L-缬氨酸产量为6.5g/L，比出发菌株产量提高103％，具有极显著差异(P＜0.01)。50L罐发酵生产L-缬氨酸实验结果表明：出发菌株CGMCC1.299的L-缬氨酸产量为7.3g/L，而本发明专利技术的工程菌MHZ-1011的L-缬氨酸产量为18.4g/L，比出发菌株产量提高152％，具有极显著差异(P＜0.01)。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物领域，特别涉及重组菌株及其构建方法、应用。
技术介绍
L-缬氨酸(L-valine)，化学名称为L-α-氨基异戊酸，分子式为C5H11NO2，相对分子质量为117.15。呈白色结晶或结晶性粉末，无臭，味苦，在水中溶解度：25℃为88.5g/L，50℃为96.2g/L，不溶于冷乙醇，乙醚，丙酮。等电点为5.96，熔点315℃。L-缬氨酸(L-Val)是人体八种必需氨基酸之一，又是三种支链氨基酸(包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。可以广泛应用于医药工业、食品工业和饲料工业等。医药工业中，可作氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分，可治疗肝功能衰竭、中枢神经系统功能紊乱。如缺乏可引起神经障碍、停止发育、体重下降、贫血等。食品工业中，可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。米制糕饼中添加缬氨酸(1g/kg)，产品有芝麻香，用于面包亦能改善风味。L-缬氨酸也可用作氨基酸能量饮料与运动员饮料，有形成肌肉、强化肝功能、减轻肌肉疲劳等作用。饲料工业中，对动物的乳腺组织分泌乳汁有重要的促进作用。将其用于雏鸡饲料中，可提高雏鸡对鸡新城疫病毒的免疫能力。而且L-缬氨酸是动物饲料中的一种限制性氨基酸，所以L-缬氨酸可作为饲料添加剂改善动物日粮中氨基酸含量的不足。L-缬氨酸的生产方法有三种:提取法、化学合成法、微生物发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制、生产成本高、污染环境，难以实现工业化生产。微生物发酵法生产L-缬氨酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产L-缬氨酸最主要的方法。通过菌株的选育，以解除代谢调节中的反馈抑制和阻遏，达到过量积累L-缬氨酸的目的，是微生物发酵法工业应用最为广泛的手段。棒杆菌是用于生产L-氨基酸的代表性微生物，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、北京棒杆菌(Corynebacteriumpekinense)和黄色短杆菌(Breviabacteriumflavum)。为了改善这些微生物的L-缬氨酸生产能力，可以通过传统诱变和代谢工程等方法对生产菌株进行不断地改造。传统诱变育种，是指通过对特定出发菌株进行物理、化学或二者合并地诱变处理，再选育出营养缺陷型和/或氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制或阻遏作用，从而达到过量积累某种氨基酸的目的。代谢工程育种，就是在对代谢网络系统分析的基础上采用基因工程技术改造细胞代谢系统以提高产物得率或改进细胞性能。主要包括如下手段：对原有代谢途径的改造、新代谢途径的构建、组学规模的代谢关键途径或靶点的识别。通过理性的代谢工程构建氨基酸生产菌株，正逐渐成为氨基酸育种的主要策略。3-磷酸甘油醛脱氢酶是中心碳代谢途径中涉及的一个酶。在棒状杆菌中，它以gapA的形式存在，以NAD作为辅酶，将3-磷酸甘油醛转化为1,3-二磷酸甘油酸，而pgk基因编码的酶再将1,3-二磷酸甘油酸转化为3-磷酸甘油酸。与之相反，在链球菌和芽孢杆菌中，它以非磷酸化的NADP依赖型GADPH(非磷酸化的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶，下文中称为gapN)形式存在，其以NADP作为辅酶，将3-磷酸甘油醛转化为3-磷酸甘油酸，并产生NADPH。该过程是个单步的过程，在糖酵解中扮演重要角色，并受到NADPH/NADP比例的影响。甘油醛3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，EC1.2.1.9)是一种NADP+依赖型的氧化还原酶，它可逆地催化甘油醛3-磷酸反应生成1,3二磷酸甘油酸，如下所示：glyceraldehyde3-phosphate+phosphate+NADP+＝3-phospho-glyceroylphosphate+NADPH+H+来源于变形链球菌(streptococcusmutans)ATCC25175的甘油醛3-磷酸脱氢酶具有良好的热稳定性、化学稳定性和操作稳定性。NADH和NADPH是细胞内重要的辅酶，参与糖、脂、蛋白质三类物质代谢的绝大部分氧化还原反应，NAD/NADH和NADP/NADPH分别是其对应的氧化还原对。将来源于变形链球菌的亮甘油醛3-磷酸脱氢酶编码基因gapN导入到棒杆菌或黄杆菌中，其编码产物可以将NADP转化为NADPH，从而增加NADPH的供应，达到调节胞内NADH/NADPH平衡的效果，转化并表达的结果是使胞内氧化还原平衡也相应得到改变。此类相似的应用，其他专利就是利用NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶活性来达到提高L-赖氨酸产量棒状杆菌属菌株的方法。工程菌CGMCC1.299自身的3-磷酸甘油醛脱氢酶以gapA的形式存在，以NAD作为辅酶，将3-磷酸甘油醛转化为1,3-二磷酸甘油酸，而pgk基因编码的酶再将1,3-二磷酸甘油酸转化为3-磷酸甘油酸。此过程中产生的是NADH，而不能在缬氨酸末端合成的四步反应中应用，从而一方面造成NADH的大量积累，另一方面合成需要的NADPH又不足。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供重组菌株及其构建方法、应用。本专利技术涉及分子改造棒杆菌或短杆菌，并发酵生产L-缬氨酸的方法。具体地说，是将辅助因子为NADPH的甘油醛3-磷酸脱氢酶gapN转化导入棒杆菌或短杆菌中，从而获得胞内氧化还原平衡改变的基因工程菌。该基因编码的甘油醛3-磷酸脱氢酶可以将甘油醛3-磷酸转化为1,3二磷酸甘油酸。该基因工程菌可用于发酵生产L-缬氨酸。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了重组菌株，由编码gapN蛋白质的gapN基因导入生产L-缬氨酸的原始菌株制得；所述原始菌株为棒杆菌或短杆菌。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述重组菌株的所述原始菌株选自谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、北京棒杆菌(C.pekinense)和黄色短杆菌(B.flavum)。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述重组菌株中所述生产L-缬氨酸的原始菌株为保藏编号为CGMCC1.299的谷氨酸棒杆菌。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述重组菌株中所述编码gapN蛋白质的gapN基因以重组质粒或插入染色体的方式导入所述原始菌株。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述重组菌株中所述编码gapN蛋白质的gapN基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1中自5’末端本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组菌株，其特征在于，由编码gapN蛋白质的gapN基因导入生产L‑缬氨酸的原始菌株制得；所述原始菌株为棒杆菌或短杆菌。

【技术特征摘要】
1.重组菌株，其特征在于，由编码gapN蛋白质的gapN基因导入生产
L-缬氨酸的原始菌株制得；所述原始菌株为棒杆菌或短杆菌。
2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述原始菌株选自谷
氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、北京棒杆菌(C.pekinense)和黄色短杆菌(B.
flavum)。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌株，其特征在于，所述生产L-缬氨
酸的原始菌株为保藏编号为CGMCC1.299的谷氨酸棒杆菌。
4.根据权利要求1至3任一项所述的重组菌株，其特征在于，所述编码
gapN蛋白质的gapN基因以重组质粒或插入染色体的方式导入所述原始菌株。
5.根据权利要求1至4任一项所述的重组菌株，其特征在于，所述编码
gapN蛋白质的gapN基因的核苷酸序列如SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱亚然，毛贤军，刁刘洋，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13