人源白细胞介素6的siRNA、重组表达CAR-T载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种人源白细胞介素6的siRNA、重组表达CAR‑T载体及其构建方法和应用。本发明专利技术所述的IL‑6敲减siRNA表达框及其siRNA表达产物，不仅可以应用于CAR19‑T治疗急性B淋巴细胞白血病(ALL)中用于消除或减轻CRS的症状，还可应用于缓解CAR‑T治疗诸如B淋巴瘤、胰腺癌、脑胶质瘤、骨髓瘤等等所有类型肿瘤时引起的CRS症状，甚至还可以应用于缓解其他类型的治疗引起的CRS。

Its construction method and application of CAR T expression vector of human interleukin 6 and recombinant siRNA

The invention discloses a human interleukin siRNA, 6 recombinant expression vector of T CAR and construction method and application thereof. The IL 6 knockdown of siRNA expression and siRNA expression of box products, not only can be applied to the CAR19 T treatment of acute B lymphocytic leukemia (ALL) is used to eliminate or reduce the symptoms of CRS, can also be used to relieve CAR T treatment such as B lymphoma, pancreatic cancer, brain glioma, bone marrow the tumor and so on all types of tumors caused by CRS symptoms, even can also be applied to other types of treatment caused by CRS.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于肿瘤免疫治疗
，具体涉及一种人源白细胞介素6(IL-6)的siRNA、重组表达CAR-T载体(尤其是一种通过敲减IL-6的用于缓解CRS的CAR-T转基因载体)及其构建方法和应用。
技术介绍
肿瘤免疫治疗的理论基础是免疫系统具有识别肿瘤相关抗原、调控机体攻击肿瘤细胞(高度特异性的细胞溶解)的能力。1950年代，Burnet和Thomas提出了“免疫监视”理论，认为机体中经常会出现的突变的肿瘤细胞可被免疫系统所识别而清除，为肿瘤免疫治疗奠定了理论基础[BurnetFM.Immunologicalaspectsofmalignantdisease.Lancet,1967；1:1171-4]。随后，各种肿瘤免疫疗法包括细胞因子疗法、单克隆抗体疗法、过继免疫疗法、疫苗疗法等相继应用于临床。2013年一种更先进的肿瘤免疫疗法---CAR-T疗法成功用于临床，并表现了前所未有的临床疗效。CAR-T，全称是ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。CAR-T疗法在临床上最领先的有诺华的CLT019，采用CLT019治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者，六个月的肿瘤无进展生存率达到67％，其中最长的应答时间达到两年多。总部位于中国上海的上海优卡迪生物医药科技有限公司与医院合作，共治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者36例，其中完全24例，缓解比例达到66.6％。这是抗癌研究的颠覆性突破。CAR-T细胞疗法可能是最有可能治愈癌症的手段之一，并被《Science》杂志评为2013年度十大科技突破之首。CAR-T疗法虽然效果显著，但是在治疗过程中会出现一类特殊的临床综合症，临床常表现为发热，低血压，寒颤，以及出现与血清中一系列细胞因子水平显着升高有关的神经系统症状，被称为细胞因子释放综合症(CytokineReleaseSyndrome，CRS)。其发生机制是由于抗原与T细胞受体结合后，激活了T细胞，T细胞被激活后释放了包括IL-6在内的一系列细胞因子，造成了一种系统性的炎症反应，IL-6信号通路如图1所示。如果治疗不及时，很可能引起肺水肿而导致患者死亡。目前临床上可通过静脉注射抗组胺类药物(如扑尔敏)或皮质类固醇(如氢化可的松)来抑制炎症反应，但是相应的，CAR-T细胞对肿瘤的杀伤作用也被抑制，使得这类患者，有较高的复发率，影响CAR-T治疗的疗效。还有一个比较可行的方案是使用商品化的托珠单抗来控制CRS的发生程度。托珠单抗是一种人源化的IL-6受体单克隆抗体(Tocilizumab)，托珠单抗与IL-6受体发生特异性结合，阻断IL-6信号转导，从而减少急性时相反应物、降低铁调素产物、减少B细胞活化、减少骨吸收和软骨转化，以及抑制T淋巴细胞向Th17细胞的分化，从而有效控制炎症反应。但是托珠单抗也有一些很明显的缺点，首先是费用很高。一支10kg体重剂量的托珠单抗价格约为2000元RMB，成年患者一般一次要用5支，普通家庭难以承受。其次是使用托珠单抗后，由于封闭了IL-6受体，导致患者后期很容易遭受感染。自从20世纪90年代以来，研究人员发现双链RNA(“dsRNA”)可以用来抑制蛋白表达。这种沉默基因的能力在治疗人类疾病方面具有具有广泛的潜力，和许多研究人员和商业实体目前投入相当大的资源在发展中基于这种技术的治疗方法。从机制的角度来看，当dsRNA进入植物和无脊椎动物细胞后，被III型核酸内切酶Dicer分解成siRNA。【Sharp,RNAinterference-2001,GenesDev.2001,15:485】。III型核糖核酸酶Dicer，将dsRNA分解成带有2碱基凸出3’粘性末端的19-23bp的siRNA。【Bernstein,Caudy,Hammond,&Hannon,RoleforabidentateribonucleaseintheinitiationstepofRNAinterference,Nature2001,409:363】。siRNA与RNA诱导的沉默复合体(RISC)整合，复合体中一个或多个解旋酶解开双链siRNA，使互补反义链引导靶点识别。【Nykanen,Haley,&Zamore,ATPrequirementsandsmallinterferingRNAstructureintheRNAinterferencepathway,Cell2001,107:309】。在结合相应的目标mRNA后，RISC复合物中的一个或多个核酸内切酶切割目标mRNA引起mRNA沉默。【Elbashir，Elbashir,Lendeckel,&Tuschl,RNAinterferenceismediatedby21-and22-nucleotideRNAs,GenesDev2001,15:188】。这种干扰效应可以持续很久，而且在细胞分裂后仍然有效。并且，RNAi具有非常好的序列特异性【Kisielow,M.etal.(2002)Isoform-specificknockdownandexpressionofadaptorproteinShcAusingsmallinterferingRNA,J.ofBiochemistry363:1-5】。因此，RNAi系统可以特异性敲减一种类型的转录本，而不影响序列相近的其它mRNA。这些特性使siRNA系统在抑制基因表达、基因功能研究和药物靶点验证方面表现出潜力和价值。此外，siRNA系统可以用来治疗相关疾病，包括(1)基因过表达或错误表达引起的疾病；(2)的基因突变引起的疾病。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种人源白细胞介素6的siRNA、重组表达载体及其构建方法和应用。本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：本专利技术的第一目的在于提供一种人源白细胞介素6的siRNA，所述siRNA选自下述中的a-h中的任一对：a.SEQIDNO.43和SEQIDNO.44所示的核苷酸序列；b.SEQIDNO.45和SEQIDNO.46所示的核苷酸序列；c.SEQIDNO.47和SEQIDNO.48所示的核苷酸序列；d.SEQIDNO.49和SEQIDNO.50所示的核苷酸序列；e.SEQIDNO.51和SEQIDNO.52所示的核苷酸序列；f.SEQIDNO.53和SEQIDNO.54所示的核苷酸序列；g.SEQIDNO.55和SEQIDNO.56所示的核苷酸序列；h.SEQIDNO.57和SEQIDNO.58所示的核苷酸序列。进一步的，优选b.SEQIDNO.45和SEQIDNO.46所示的核苷酸序列。本专利技术的第二目的在于提供上述siRNA在制备治疗缓解细胞因子释放综合症药物中的应用。本专利技术的第三目的在于提供一种包含上述siRNA的重组表达载体。进一步的，所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或质粒；优选的，包含上述siRNA的慢病毒表达载体。进一步的，所述的慢病毒表达载体包括：用于质粒复制的原核复制子pUCOri序列，如SEQIDNO.2所示；用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因Amp本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人源白细胞介素6的siRNA，所述siRNA选自下述中的a‑h中的任一对：a.SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列；b.SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46所示的核苷酸序列；c.SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列；d.SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50所示的核苷酸序列；e.SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52所示的核苷酸序列；f.SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列；g.SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56所示的核苷酸序列；h.SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种人源白细胞介素6的siRNA，所述siRNA选自下述中的a-h中的任一对：a.SEQIDNO.43和SEQIDNO.44所示的核苷酸序列；b.SEQIDNO.45和SEQIDNO.46所示的核苷酸序列；c.SEQIDNO.47和SEQIDNO.48所示的核苷酸序列；d.SEQIDNO.49和SEQIDNO.50所示的核苷酸序列；e.SEQIDNO.51和SEQIDNO.52所示的核苷酸序列；f.SEQIDNO.53和SEQIDNO.54所示的核苷酸序列；g.SEQIDNO.55和SEQIDNO.56所示的核苷酸序列；h.SEQIDNO.57和SEQIDNO.58所示的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的siRNA在制备治疗缓解细胞因子释放综合症药物中的应用。3.一种包含权利要求1所述的siRNA的重组表达载体。4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或质粒。5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述的慢病毒表达载体包括：用于质粒复制的原核复制子pUCOri序列，如SEQIDNO.2所示；用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列，如SEQIDNO.1所示；用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子SV40Ori序列，如SEQIDNO.3所示；用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件；用于真核细胞表达绿色荧光的ZsGreen1绿色荧光蛋白，如SEQIDNO.11所示；用于共同转录表达蛋白质的IRES核糖体结合序列，如SEQIDNO.12所示；用于嵌合抗原受体基因的真核转录的人EF1α启动子，如SEQIDNO.14所示；用于组成集识别、传递、启动于一体的二代CAR或三代CAR的抗CD19嵌合抗原受体的编码基因，如SEQIDNO.52或SEQIDNO.53所示；用于增强转基因的表达效率的eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，如SEQIDNO.13所示；用于胞内转录siRNA的人RNA聚合酶III启动子hU6，如SEQIDNO.14所示。6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述慢病毒包装顺式元件采用第二代慢病毒载体包括：如SEQIDNO.5所示的慢病毒5terminalLTR、如SEQIDNO.6所示的慢病毒3terminalSelf-InactivatingLTR、如SEQIDNO.7所示的Gag顺式元件、如SEQIDNO.8所示的RRE顺式元件、如SEQIDNO.9所示的env顺式元件、如SEQIDNO.10所示的cPPT顺式元件。7.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述慢病毒包装顺式元件采用第三代慢病毒载体包括：如SEQIDNO.5所示的慢病毒5terminalLTR、如SEQIDNO.6所示的慢病毒3terminalSelf-InactivatingLTR、如SEQIDNO.7所示的Gag顺式元件、如SEQIDNO.8所示的RRE顺式元件、如SEQIDNO.9所示的env顺式元件、如SEQIDNO.10所示的cPPT顺式元件所述慢病毒包装顺式元件，以及如SEQIDNO.4所示的RSV启动子。8.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件有6个核苷酸的增强突变，具体为：g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T。9.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述抗CD19嵌合抗原受体，包括依次串联的如SEQIDNO.16所示的CD8leader嵌合受体信号肽、如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：祁伟，康立清，俞磊，夏荣华，
申请(专利权)人：上海优卡迪生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31