一种大肠杆菌高强度组合启动子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种大肠杆菌高强度组合启动子及其应用，属于合成生物技术领域。本发明专利技术提供了高转录强度启动子PssrA、PdnaKJ、PgrpE、PalsRBACE和高翻译强度启动子PrpsT。分别将PssrA、PdnaKJ、PgrpE、PalsRBACE和PrpsT融合后得到4种具有高表达强度的组合启动子。该组合启动子的最高强度为10mM阿拉伯糖诱导的PBAD启动子的1.7倍。该组合启动子是一种安全且高效的基因表达元件。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种大肠杆菌高强度组合启动子及其应用，属于合成生物

技术介绍
作为基因表达的第一个控制元件，通过调控启动子的强度来控制其下游基因的表达水平成为了最直接有效的手段。在代谢工程改造过程中，模块化等策略利用不同拷贝数的质粒和IPTG诱导的启动子成功的对代谢路径的多个基因表达水平进行了微调，极大地增加了目的产物产量。目前，大肠杆菌中最常用的是一系列的诱导型启动子，然而由于诱导型启动子的数量限制，因此这些启动子往往难以做到对每一个基因表达强度进行精确调控。微生物的基因组上携带有大量的天然启动子，这些启动子强度多样，具有应用于代谢工程改造的巨大潜力。然而，由于大部分组成型启动子的强度未知，以及与强度对应的启动子精确序列未知使得直接利用组成型启动子进行基因表达困难重重。此外大部分的天然启动子的转录强度于基因的翻译强度不统一，往往具有高转录水平的启动子翻译的蛋白质却并不高，而低转录水平的启动子却拥有较高的蛋白质表达水平。基因组上往往多个启动子、增强子和衰减子等元件共同调节一个基因的表达，因此不同长度的启动子区域其功能也不尽相同。如何找到具有高转录强度和高翻译强度的组成型启动子成为了关键。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术首先提供了一组大肠杆菌组成型启动子，明确测定出其转录强度和翻译强度，提供了其明确的DNA序列。本专利技术为避免基因表达过程中的诱导剂添加提供了选择，同时可用于调节多基因的表达途经，控制菌体代谢流向。所述大肠杆菌组成型启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.6～9任一所示。本专利技术还提供一种表达载体，具有核苷酸序列如SEQIDNO.6～9任一所示的启动子。所述表达载体的骨架包括常见的大肠杆菌的表达载体。本专利技术提供应用所述启动子构建的重组菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌的宿主包括各种现有大肠杆菌表达宿主。在本专利技术的一种实施方式中，应用所述启动子构建的重组菌，是利用所述的启动子连接目的基因，构建重组质粒，并在宿主中表达。在传统的基因工程研究中，诱导型启动子常常被用来表达相关基因，然而由于需要添加诱导剂和难以实现同时对多个基因表达强度进行微调，诱导型启动子难以应用于多基因表达途径。来源于基因组的组成型启动子往往由于其表达强度较低同样难以满足要求。本专利技术提供的4种具有梯度强度的高强度组合启动子不需要额外的添加诱导剂，具备高转录强度和高翻译强度，同时其具有一定的强度梯度(启动子强度跨度为7.7倍)可用于对多基因表达途径进行微调。具体实施方式材料与方法大肠杆菌JM109用于质粒构建，大肠杆菌K12MG1655用于表达蛋白测定启动子强度。实施例1分析大肠杆菌转录组数据，以大肠杆菌K12MG1655基因组为模版，扩增启动子PssrA、PdnaKJ、PgrpE、PalsRBACE和PrpsT。为测定这5个启动子的强度，以融合PCR的方式融合PssrA、PdnaKJ、PgrpE、PalsRBACE、PrpsT和报告基因EGFP。为测定并构建高强度组合启动子，以融合PCR的方式将启动子PssrA、PdnaKJ、PgrpE和PalsRBACE的转录控制区域(-10区和-35区)与启动子PrpsT的5'-UTR区域融合，从而构建得到4种组合启动子PssrA-rpsT、PdnaKJ-rpsT、PgrpE-rpsT和PalsRBACE-rpsT。随后将组合启动子与EGFP基因以融合PCR的方式融合用来测定组合启动子强度。PCR扩增反应均由高保真DNA聚合酶PrimeSTARHS(premix)(TaKaRa)扩增。扩增引物见表1。表1所用引物序列人工序列将融合PCR产物经过BamHI/SacI双酶切后与同样双酶切的pCDFDuet-1质粒连接，化学转化大肠杆菌K12MG1655中。测序正确的菌株用于后续的启动子强度测定。1、转录强度重组菌于LB培养基或MOPS中37℃，220rpm条件下培养，培养至稳定期(11h)后于4000rpm，4℃离心收集菌体，提取菌体的总mRNA，反转录后进行实时定量PCR检测，测定EGFP的胞内mRNA丰度，检测结果显示，采用启动子PssrA、PdnaKJ、PgrpE、PalsRBACE和PrpsT，其mRNA丰度分别是10mM阿拉伯糖诱导的PBAD启动子的46.3、25.6、8.3、6.4和0.0047倍。2、翻译强度为了测定组成型启动子PssrA、PdnaKJ、PgrpE、PalsRBACE和PrpsT的翻译强度，以EGFP为表达基因，于大肠杆菌MG1655中稳定期检测胞内检测胞内EGFP水平。重组菌于LB或MOPS培养基中37℃，220rpm条件下培养，培养至稳定期(11h)后于4000rpm，4℃离心收集菌体，利用PBS(pH＝7.4)缓冲液清洗细胞2次，以除去死菌体、菌体分泌物和培养基沉淀成分从而降低荧光检测背景。将清洗后的菌体至于96孔荧光板中于多功能荧光酶标仪检测荧光强度和菌体OD600，检测条件为488nm激发，520nm发射。启动子翻译强度为荧光强度与OD600的比值。荧光酶标仪检测结果显示，启动子PssrA、PdnaKJ、PgrpE、PalsRBACE和PrpsT的翻译强度分别为10mM阿拉伯糖诱导的PBAD启动子的0、0.16、0.06、0.016和0.26倍。对比启动子PssrA、PdnaKJ、PgrpE、PalsRBACE和PrpsT对EGFP的转录和翻译强度发现，启动子PssrA、PdnaKJ、PgrpE和PalsRBACE具有较高的转录强度，而翻译强度相对较低。启动子PrpsT具有较低的转录强度，而翻译强度较高。分析原因，可能是由于启动子PssrA、PdnaKJ、PgrpE和PalsRBACE含有强的转录控制区域(-10区和-35区)而启动子PrpsT则具有较强的5'-UTR区域。因此结合双方优势有可能构建得到高强度的组合启动子3、组合启动子的翻译强度为了测定经过启动子工程改造后的组合启动子PssrA-rpsT、PdnaKJ-rpsT、PgrpE-rpsT和PalsRBACE-rpsT的表达强度，以EGFP为表达基因，于大肠杆菌MG1655中稳定期检测胞内检测胞内EGFP水平。荧光酶标仪检测结果显示组合启动子的翻译强度分别为10mM阿拉伯糖诱导的PBAD启动子的1.70、1.37、0.80和0.22倍。由此可知，经过启动子工程得到的四种组合启动子PssrA-rpsT、PdnaKJ-rpsT、PgrpE-rpsT和PalsRBACE-rpsT同时具备了PssrA、PdnaKJ、PgrpE和PalsRBACE启动子的高转录效率和PrpsT启动子的高翻译效率。4、组合启动子表达基因的普适性由于四种组合启动子均具有相同的5'-UTR区域，因此，为了检测这组合串联启动子5'-mRNA对于不同基因的表达能力，可以只选取启动子PssrA-rpsT表达其他的报告基因，并测定其表达强度，从而确定来源于PrpsT的5'-mRNA对不同基因表达的影响。分别用PssrA-rpsT组合启动子与红色荧光蛋白(RFP)和β-半乳糖苷酶(LacZ)融合表达，随后测定其翻译强度分别为PBAD启动子的1.4倍和1.7倍。实验证明，针对不同的目的基因，组合启动子同样具有较高的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种控制基因表达的元件，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6～9任一所示。

【技术特征摘要】
1.一种控制基因表达的元件，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.6～9任一所示。2.一种梯度强度的控制基因表达的元件，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQIDNO.6～9所示的启动子中的至少2个。3.一种表达载体，其特征在于，其基因表达控制元件的核苷酸序列如SEQIDNO.6～9任一所示。4.根据权利要求3所述的一种表达载体，其特征在于，所述表达载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，陈坚，周胜虎，堵国成，李华钟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32