核酸及其用途制造技术

本申请提出了一种分离的核酸，该核酸含有miRNA靶基因结合位点序列。发明专利技术人发现，利用根据本发明专利技术实施例的分离的核酸可实现miRNA的下调，尤其对高CG含量(CG含量高达90％)的miRNA，其下调效率相对于现有技术显著提高。

Nucleic acids and uses thereof

The present invention provides a separate nucleic acid containing miRNA target gene binding site sequence. The inventors have found that the use of isolated nucleic acids according to the embodiment of the invention can reduce the miRNA, especially for miRNA with high CG content (CG content up to 90%), and the reduction efficiency is significantly improved compared with the prior art.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物领域，具体的，本专利技术涉及分离的核酸、下调细胞中miRNA的方法以及建立miRNA稳定下调细胞系的方法。
技术介绍
microRNA(miRNA)是一类由真核生物内源性表达产生的单链非编码RNA。miRNA能够以碱基互补配对的方式结合靶基因转录的mRNA的3’UTR区，极少数结合于5’UTR区或者ORF区，使靶基因的mRNA降解，或者抑制其翻译，从而下调目的蛋白的表达，来调节基因的表达，单个microRNA分子可调控的靶基因数量为200个以上，并且已有很多证据表明miRNA在造血分化中，肿瘤发生，炎症反应等各个生理以及病例情况下，都发挥了重要作用。但是目前仍有许多miRNA的生物学功能和相应的分子机制需要被实验证实，因此miRNA的表达量的调节具有着十分重大的意义。特别是miRNA的功能性下调或缺失可以充分暴露出内源性miRNA的功能。目前已有的miRNA的下调方法有以下三种：基因敲除，miRNAinhibitor和miRNA海绵。基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞中编码该miRNA的基因组上某一确定的位点，可以特异的靶向和敲除单个的miRNA分子的上游编码基因，来削弱内源miRNA的基因的沉默效应，以达到定点修饰改造染色体上某一基因目的的一种技术。miRNAinhibitor是化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的寡核苷酸，与其靶向的miRNA互补配对，作为mRNA结合的竞争性抑制剂，由于inhibitor也是一条寡核苷酸，会被细胞内的RNase降解，所以不能持续维持对miRNA的抑制作用。2007年，麻省理工大学的PhillipSharp及他的同事利用相似的原理，开发出一种长期抑制miRNA基因的高效方法，称之为miRNA海绵(miRNAsponge)，miRNA海绵是一条mRNA，其3’非翻译区(UTR)包含若干个miRNA靶定位点(通常是成熟miRNA的反向互补序列)，这样它就无法与天然靶点结合。更重要的是，这些靶定位点在RISC切割位点有一些错配。这样，抑制剂mRNA就不会被降解，而与RISC稳定结合，让它远离天然的mRNA靶点。然而，目前对于miRNA的功能性敲除的方法仍需改进。
技术实现思路
本专利技术是基于专利技术人对以下问题和事实的发现而提出的：专利技术人在实验中发现，当采用miRNA海绵技术去实现对高CG含量的miRNA的持续下调时，由于大量单纯重复的序列导致了mRNA合成的难度大，所合成的mRNA下调miRNA的效果并不理想。为了克服这个技术难点，专利技术人只将miRNA靶基因结合位点序列顺序合成出并首尾连接，专利技术人惊喜地发现，所获得的核苷酸序列导入受体细胞中，依然可实现对受体细胞中miRNA的高效下调，尤其对于含有高CG含量的miRNA，不仅mRNA合成的难度大大降低，所获得的核苷酸序列对于高CG含量的miRNA的下调效果也异常显著。基于此，在本专利技术的第一方面，专利技术人提出了一种分离的核酸。根据本专利技术的实施例，所述核酸含有miRNA靶基因结合位点序列。专利技术人发现，利用根据本专利技术实施例的分离的核酸可实现miRNA的下调，尤其对高CG含量的miRNA(CG含量高达90％)，其下调效率相对于现有技术显著提高。根据本专利技术的实施例，上述分离的核酸还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述miRNA靶基因结合位点序列包括miRNA靶基因互补配对序列和miRNA靶基因辅助结合位点序列，所述miRNA靶基因辅助结合位点序列位于所述miRNA靶基因互补配对序列的5’端和/或3’端。需要说明的是，所述“miRNA靶基因互补配对序列”为miRNA与靶基因的结合位点上的能够互补配对的部分；所述“miRNA靶基因辅助结合位点序列”为除了miRNA与靶基因的结合位点上的互补配对的碱基以外的其它碱基序列，具有辅助识别结合位点的功能。专利技术人发现，所述miRNA靶基因结合位点序列包括miRNA靶基因互补配对序列和miRNA靶基因辅助结合位点序列，使得本申请的分离的核酸对miRNA的吸附、靶向效果进一步增强。根据本专利技术的实施，所述miRNA靶基因结合位点序列的长度为15～40bp。根据本专利技术的实施例，所述miRNA靶基因结合位点序列的数量为至少一个。需要说明的是，本申请的分离的核酸上的至少一个的miRNA靶基因结合位点序列的连接顺序不受特别限制。根据本专利技术的实施例，所述相邻两个miRNA靶基因结合位点序列之间是由连接序列连接的。根据本专利技术的实施例，所述连接序列由至少一个碱基组成。连接序列的长度在本专利技术实施例的分离的核酸中不受特别限制，只要连接序列不干扰miRNA靶基因结合位点序列与miRNA的吸附和靶向，分离的核酸能够实现对目标miRNA特异性下调即可。根据本专利技术的实施例，所述连接序列由至少一个A和/或T组成。根据本专利技术的具体实施例，连接序列碱基的可为任何碱基，而选择A和/或T组成作为连接序列的待选碱基，可有效控制本专利技术实施例的分离的核酸中的CG含量，进而可有效降低分离核酸的合成难度，以及有效增加分离核酸的下调miRNA的效果。根据本专利技术的实施例，所述连接序列具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。AA(SEQIDNO：1)。根据本专利技术具体的实施例，所述miRNA为miR-1915-3p。利用根据本专利技术实施例的分离的核酸，可高效实现具有高GC含量的miR-1915-3p的下调，进而为进一步研究内源性miR-1915-3p的功能奠定了良好的技术基础。根据本专利技术的实施例，所述核酸具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。GACCAUCUUUCCAACCCCUGGGGAAGACAAAUGUCUCAGCUCACUUCCCUGGGACAUUCAAAAGCUGGCCCUGCCUCCUGGGAAGAUGAAAGAGCACUUUGCAACUCCCUGGGUAAGAGAAACUUGCAUUUCUUUGCCCUGGGGGCUGUAAUGGCUGGGCCUGUCACCCUGGGGCCCUAAGGGAAGGAACAGAGGCCCUGGGCCCUUCAAUGAAGGUUUCCUCGUCCCUGGGCAAUUAAUUCAGCAAGAGGUGACCCUGGGAGCGUAAUGGUUCCCCACGCAGCCCUGGGGCUUGG。(SEQIDNO：2)。根据本专利技术的实施例，具有SEQIDNO：2所示核苷酸序列的分离的核酸可实现细胞内miR-1915-3p的高效下调，进而为进一步研究内源性miR-1915-3p的功能奠定了良好的技术基础。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种构建体。根据本专利技术的实施例，所述构建体携带前面所述的核酸。利用根据本专利技术实施例的构建体，可将前面所述的核酸采用本领域技术人员所熟知的方式导入受体细胞中，进而实现前面所述核酸在受体细胞中的稳定表达，所述核酸在受体细胞中可实现对miRNA的稳定和持续地下调，尤其对高CG含量的miRNA(CG含量高达90％)的下调效果尤为显著。根据本专利技术的实施例，上述构建体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述构建体的载体为pCDNA3.1。pCDNA3.1可携带前面所述的核酸在真核细胞中的高效表达，进而实现对真核细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸，其特征在于，含有miRNA靶基因结合位点序列。

【技术特征摘要】
1.一种分离的核酸，其特征在于，含有miRNA靶基因结合位点序列。2.根据权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，所述miRNA靶基因结合位点序列包括miRNA靶基因互补配对序列和miRNA靶基因辅助结合位点序列，所述miRNA靶基因辅助结合位点序列位于所述miRNA靶基因互补配对序列的5’端和/或3’端，任选地，所述miRNA靶基因结合位点序列的长度为15～40bp，任选地，所述miRNA靶基因结合位点序列的数量为至少一个。3.根据权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，相邻两个miRNA靶基因结合位点序列之间是由连接序列连接的，任选地，所述连接序列由至少一个碱基组成；优选地，所述连接序列由至少一个A和/或T组成；任选地，所述连接序列具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，所述miRNA为miR-1915-3p。5.根据权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，所述核酸具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。6.一种构建体，其特征在于，携带权利要求1～5任一项所...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴雪涛，曲洺逸，谢小燕，岳文，曾泉，房芳，陈琳，南雪，姚海雷，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所，华南生物医药研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11