大豆低温诱导型启动子、包含该启动子的重组表达载体及应用，本发明专利技术涉及植物基因工程领域，具体涉及大豆基因启动子序列在低温胁迫下可以作为启动子调控基因的表达。本发明专利技术的目的是为了解决有效的大豆低温诱导型启动子未被研制出来的问题。本发明专利技术的启动子来源于大豆乙烯响应因子基因GmERF9的启动子序列，命名为GmERF9P，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。所述的序列中含有多种与胁迫相关的顺式作用元件。所述顺式作用元件分别为GT‑1、BIHD10S、WRKY、MYB、MYC和G‑box。本发明专利技术的大豆低温诱导型启动子用于在低温下诱导抗寒基因表达。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程领域，具体涉及大豆基因启动子序列在低温胁迫下可以作为启动子调控基因的表达。
技术介绍
大豆是重要的经济作物，在世界范围内普遍种植，不仅是人类蛋白和脂类的主要来源，同时也是重要的家畜饲料和工业原料，在医学上也有很大价值。然而低温、干旱、高盐等不利环境条件会对大豆的生长和发育产生影响，从而导致大豆产量降低，造成严重的经济损失。除了常规育种技术，近年来随着分子生物学的发展和植物基因工程育种技术的成熟，应用基因工程方法改良大豆抗逆性成为可能。启动子是DNA分子上位于结构基因上游，结合RNA多聚酶从而启动结构基因转录的一段DNA序列。基因表达效率主要取决于启动子的活性，高水平的表达内源或外源基因需要有高效的启动子。在基因工程中，目前常用CaMV35S等一些组成型启动子来控制目的基因的表达。这些启动子虽然能使目的基因过量表达，但它们是无组织、无环境、无时间特异性的组成型表达。利用组成型启动子控制抗逆相关基因的表达虽然可以提高植物在逆境条件下的抗逆能力，但即使在植物正常情生长情况下相关抗逆蛋白也会过量表达，这对植物代谢来说是一种浪费。并且正常环境下植物体内抗逆蛋白的长时间过量积累也会对植物的正常生长产生负面影响，引起转基因植物形态发生异常，生长延缓甚至是死亡。而逆境诱导启动子仅在植物遭受逆境胁迫时才大量启动下游基因的表达，可以避免外源基因在转基因植物中持续表达所引起的植物生长缺陷。因此克隆并应用逆境诱导型启动子，可以实现高效、可控和特异(定点、定时、定量)的调控抗逆基因的表达，在改良植物的抗逆性方面具有极大的优越，成为当前研究的热点。目前国内外存在一些有关低温诱导启动子的报道。例如拟南芥rd29A启动子可以被低温、干旱和高盐等非生物胁迫诱导，是目前抗逆基因工程中应用最广泛的诱导型启动子。从冬麦中获得受低温诱导的blt101.1启动子。从野生稻中克隆出且具有低温诱导表达特性的冷诱导启动子p-LTT1。从水稻品种日本晴中获得低温强诱导启动子POscold6，该启动子能够特异的驱动外源基因在低温/冷胁迫条件下在植物中表达。但总的来说，目前能在基因工程中应用的低温诱导型启动子仍然不多，因此，对有效的新的低温诱导型启动子的克隆及研究仍然是今后研究的重点。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决有效的大豆低温诱导型启动子未被研制出来的问题，而提供了大豆低温诱导型启动子、包含该启动子的重组表达载体及应用。。本专利技术的启动子来源于大豆乙烯响应因子基因GmERF9的启动子序列，命名为GmERF9P，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。所述的序列中含有多种与胁迫相关的顺式作用元件。包含大豆低温诱导型启动子的重组表达载体，其重组表达载体的原始载体为pCAMBIA1301。本专利技术的大豆低温诱导型启动子在低温下诱导抗寒基因表达中的应用。本专利技术利用实时荧光定量PCR技术检测大豆叶片中GmERF9基因在4℃处理2h时的表达量，此时GmERF9的表达量显著升高，证明GmERF9基因具有低温诱导表达特性。因此，在大豆基因组数据库中搜索GmERF9基因上游大概2000bp序列，设计引物，从大豆叶片基因组中克隆出1885bp的GmERF9启动子序列，命名为GmERF9P。将GmERF9P构建到植物表达载体pCAMBIA1301上，通过叶盘法转化烟草。通过潮霉素筛选和PCR鉴定，获得T1代阳性转基因烟草。对转基因烟草进行低温处理2h。对未处理烟草及低温处理烟草进行GUS组织化学染色和实时荧光定量PCR检测GUS基因的表达量，表明GmERF9P在低温胁迫下具有低温诱导启动特性，为低温诱导型启动子。本专利技术相对于现有技术的优点：利用组成型启动子控制抗逆相关基因的表达虽然可以提高植物在逆境条件下的抗逆能力，但即使在植物正常情生长情况下相关抗逆蛋白也会过量表达，这对植物代谢来说是一种浪费。并且正常环境下植物体内抗逆蛋白的长时间过量积累也会对植物的正常生长产生负面影响，引起转基因植物形态发生异常，生长延缓甚至是死亡。而逆境诱导启动子仅在植物遭受逆境胁迫时才大量启动下游基因的表达，可以避免外源基因在转基因植物中持续表达所引起的植物生长缺陷。本专利技术克隆了一个大豆低温诱导型启动子，该启动子的获得为植物抗寒基因工程研究提供有利工具，可在低温条件下启动抗寒相关基因的高效表达，从而培育出实用有效的抗寒植物品种。附图说明图1GmERF9基因在低温处理0h和2h时表达量的实时荧光定量PCR检测结果；图2GmERF9基因启动子序列的PCR扩增结果，其中M为DL2000Marker，1为扩增条带；图3GmERF9P启动子序列顺式作用元件预测分析；图4重组载体pCAMBIA1301-GmERF9P的质粒双酶切结果，其中M为DL2000Marker，1-3为双酶切条带；图5GmERF9PT1代阳性转基因烟草PCR鉴定结果，其中M为DL2000Marker，1-6为T1代阳性转基因烟草扩增条带，7为野生型烟草阴性对照，8为pCAMBIA1301-GmERF9P质粒阳性对照；图6未处理野生型烟草叶片GUS组织化学染色结果；图7低温处理2h野生型烟草叶片GUS组织化学染色结果；图8未处理T1代转基因烟草叶片GUS组织化学染色结果；图9低温处理2hT1代转基因烟草叶片GUS组织化学染色结果；图10GUS基因在转基因烟草中低温处理2h时表达量的实时荧光定量PCR检测结果，其中1为未处理T1代转基因烟草中GUS基因表达量，2为低温处理2h时T1代转基因烟草中GUS基因表达量，3为阳性对照pCAMBIA1301转基因烟草中GUS基因表达量。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意合理组合。具体实施方式一：本实施方式的大豆低温诱导型启动子的序列如序列表中SEQIDNO：1所示。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述的序列中含有与胁迫相关的顺式作用元件。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是，所述顺式作用元件分别为GT-1、BIHD10S、WRKY、MYB、MYC和G-box。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。具体实施方式四：本实施方式的包含大豆低温诱导型启动子的重组表达载体。具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是，所述重组表达载体的原始载体为pCAMBIA1301。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。具体实施方式六：本实施方式大豆低温诱导型启动子在低温下诱导抗寒基因表达中的应用。实施例1：本实施例将从以下实验对本专利技术的大豆低温诱导型启动子的序列进行验证：(一)低温处理下GmERF9基因表达量的实时荧光定量PCR检测将正常条件下盆栽的四叶期大豆幼苗置于4℃培养箱中进行低温处理，在处理0h和2h时，分别剪取0.1g叶片迅速置于液氮中，-80℃保存备用。采用PlantRNAzol试剂(购自北京鼎国生物技术公司)提取大豆低温处理及未处理时叶片总RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒(购自北京鼎国生物技术公司)的说明书合成第一链cDNA。根据GmERF9基因(GenBank登录号：AK245092)cDNA序列设计实时荧光定量PCR引物(F:5′-CATACCA本文档来自技高网...
【技术保护点】
大豆低温诱导型启动子，其特征在于：该启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.大豆低温诱导型启动子，其特征在于：该启动子的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的大豆低温诱导型启动子，其特征在于：所述的序列中含有与胁迫相关的顺式作用元件。3.根据权利要求1所述的大豆低温诱导型启动子，其特征在于：所述顺式作用元件为GT-1、BIH...
【专利技术属性】
技术研发人员：翟莹，邵淑丽，张军，赵艳，任巍巍，张闯，
申请(专利权)人：齐齐哈尔大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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