本发明专利技术属于生物医药领域，涉及重组大肠杆菌工程菌。所述的重组大肠杆菌工程菌转化有重组表达载体，所述的重组表达载体含有表达抗TNF抗体Fab片段的基因和表达二硫键异构酶的基因。用本发明专利技术的重组大肠杆菌工程菌表达抗TNF抗体Fab片段，可以在明显提高周质空间表达量的同时明显促进二硫键的正确形成。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术一般的涉及重组大肠杆菌工程菌，特别的涉及表达抗体Fab片段的重组大肠杆菌工程菌。
技术介绍
抗体(antibody，Ab)是一种由抗原(例如细菌、病毒及它们的组分，异源蛋白质)诱导，由机体淋巴细胞(浆细胞)合成与分泌的，用来鉴别与中和抗原的免疫球蛋白类物质。抗体分为多克隆抗体(polyclonal antibody，pAb)和单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)，其中前者是由异源抗原或不同的抗原表位刺激机体产生的，后者是由同源抗原乃至相同的抗原表位刺激机体产生的。因此，单克隆抗体较多克隆抗体特异性更强，灵敏度更高，但制备难度与成本也更高。传统的抗体分子由两条相同的轻链(light chain，LC)与两条相同的重链(heavy chain，HC)形成对称的Y形结构，分子量150KD左右，轻链和重链靠近N端的一侧形成可变区(variable region，VR，不同抗体的同型可变区氨基酸序列不同)，包括重链可变区(heavy chain variable region，HV)与轻链可变区(light chain variable region，LV)；靠近C端的一侧形成恒定区(constant region，CR，不同抗体的同型恒定区氨基酸序列相同)，包括重链恒定区(heavy chain constant region，Hc)与轻链恒定区(light chain constant region，Lc)。而重链和轻链可变区又分别由交错排布的四个框架区(framework region，FR，不同抗体的氨基酸序列变化较小)与三个互补决定区(complementarity determining region，CDR，不同抗体的氨基酸序列变化较大，尤其是CDR3)组成。两侧的重链和轻链之间均通过二硫键连接起来，两条重链之间亦通过二硫键连接。哺乳动物抗体分子的重链一共有五种，分别用希腊字母α、δ、ε、γ和μ来命名，相对应的抗体分别称为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。不同的重链在大小和组成上有所区别，α和γ包含大约450个氨基酸，而μ和ε则有大约550个氨基酸。哺乳动物抗体分子轻链只有λ型和κ型两种类型。轻链的长度大约为211～217个氨基酸。抗体分子可以被蛋白水解酶如木瓜蛋白酶水解成2个Fab段和一个Fc段，或者被胃蛋白酶从铰链区(用于连接Fab和Fc段的富含脯氨酸的结构区域，其包含了重链间的二硫键)断开，水解成一个F(ab)2段和一个Fc段。Fab片段是由重链Fd段和完整轻链通过链间二硫键形成的异二聚体，质量约占抗体分子的1/3。由于缺少Fc段，Fab段既不会和抗原发生沉淀，也不会在活体研究中被免疫细胞捕获。传统的单克隆抗体是通过杂交瘤细胞技术制备的，属于鼠源性抗体。为了降低乃至消除鼠源性抗体用于人体引起的人抗鼠抗体反应(HAMA)，自上世纪80年代中后期开始，研究者探索以基因工程方法改造鼠源性单克隆抗体，从而制备出了包括嵌合抗体(将鼠抗体的恒定区替换为人抗体的恒定区)与人源化抗体(在嵌合抗体的基础上进一步将可变区的框架区替换为人抗体的框架区)的基因工程抗体，并在此基础上进一步制备获得了重组的全人序列的全人抗体。同时，鉴于完整的抗体分子因表达量及产量低、纯化及质控难、成本高等原因较难以制备，分子量过大难以穿过细胞外间隙进入细胞，容易引起免疫反应等原因，所以又采用基因工程方法使抗体分子小型化，制备出了各种小分子抗体，包括单链抗体(scFv，由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成)、Fab抗体等。抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定靶点定向制备等优点。截至2014年底，全球共有针对37种靶标的59个抗体药物产品被批准上市，针对包括各种肿瘤、自身免疫性疾病在内的36种适应症，形成了847亿美元的年市场销售额，且当年全球销售额排名前10的药物中有6个是抗体药物。而在这37种靶标中，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)是最热门的靶标，仅此一个靶标的抗体药物2014年全球销售额就达到了345亿美元，高居所有靶标抗体药物销售额之首，也使自身免疫性疾病适应症力压肿瘤适应症成为抗体药物销售额最高的适应症。以TNF为靶标的抗体药物主要针对以类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、节段性肠炎(Crohn′s disease，CD)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)、银屑病关节炎(psoriatic arthritis，PA)为代表的自身免疫性疾病的治疗。目前上市的抗TNF抗体药物主要有5种，分别为infliximab(英夫利昔单抗，商品名Remicade，嵌合抗体)、adalimumab(阿达木单抗，商品名Humira，全人抗体)、golimumab(戈利木单抗，商品名Simponi，全人抗体)、certolizumab(赛妥珠单抗，商品名Cimzia，人源化PEG修饰的Fab抗体)以及etanercept(依那西普，商品名Enbrel，TNF受体与抗体Fc段的融合蛋白)，其中adalimumab、infliximab、etanercept在2014年全球销售排名前10的药物中分别排名第1、3、4位，而certolizumab在2014年的全球销售额也达到了10亿美元以上的规模。鉴于如前所述的小分子抗体相较于完整分子抗体的优势，类比certolizumab先制备抗TNF抗体Fab片段的小分子抗体，再用PEG修饰以克服小分子抗体半衰期短、稳定性差的缺点就有了相当的可行性。虽然Fab抗体可以利用诸多表达系统，如细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫和植物表达系统表达，但应用最为广泛的还是大肠杆菌(E.coli)表达系统。但大肠杆菌表达Fab抗体最大的问题是容易形成包涵体表达造成表达产物不溶解和无活性，由此必须进一步进行的变复性过程更容易造成Fab抗体的错误折叠和二硫键(Fab抗体有4个链内和1个链间二硫键)的错误配对。解决这一问题的方法是尽量让Fab抗体表达在大肠杆菌周质空间(periplasm space)中。不过即使Fab抗体在大肠杆菌周质空间中表达，如果过量表达仍然存在错误折叠和二硫键错误配对的问题，由此对表达Fab抗体的量及其以二硫键形成为代表的正确结构的形成、生物学活性都有较大影响。现有技术中公开了一些共表达分子伴侣(molecular chaperones)类物质以解决大肠杆菌周质空间中表达抗体片段存在上述问题的方法。例如发表在Microbial Cell Factories 2010年第9卷第1期上的文献Co-expression of Skp and FkpA chaperones improves cell viability and alters the global expression of stress response genes during scFvD1.3production公开了在E.coli BL21中将scFvD1.3抗体片段与Skp或FkpA共本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组大肠杆菌工程菌，其特征是转化有重组表达载体，所述的重组表达载体含有表达抗TNF抗体Fab片段的基因和表达二硫键异构酶的基因。
【技术特征摘要】
1.重组大肠杆菌工程菌，其特征是转化有重组表达载体，所述的重组表达载体含有表达抗TNF抗体Fab片段的基因和表达二硫键异构酶的基因。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌工程菌，其特征是所述的大肠杆菌工程菌选自BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)、Arctic Express、Origami B(DE3)中的一种。3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌工程菌，其特征是所述的大肠杆菌工程菌是BL21(DE3)。4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌工程菌，其特征是所述的表达载体是质粒载体，选自pET23b、pET24a、pET28a、pET30a、pET32a、pCDFDuet-1、pET15b、pET21a、pETDuet-1、pACYC 184、pTXB 1、pTYB21。5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌工程菌，其特征是所述的表达抗TNF抗体Fab片段的基因和表达二硫键异构酶的基因位于同一或不同的重组表达载体内，且当位于不同的重组表达载体内时不同的重组表达载体之间是兼容的。6.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：童梅，刘美君，莫婷，张宇萌，徐晨，周敏毅，
申请(专利权)人：北京三元基因药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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