一种环氧琥珀酸水解酶编码基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有顺式环氧琥珀酸水解酶活性的编码基因，其序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。同时涉及将该基因在大肠杆菌工程菌株中进行分泌型表达，使重组菌有氧培养后的发酵液能够直接进行酶转化，催化顺式环氧琥珀酸水解为D‑酒石酸，该基因工程菌命名为CM‑TA‑122，保藏号为CCTCC M 2016456。本发明专利技术利用挖掘的新顺式环氧琥珀酸水解酶编码基因，建立了适合工业化操作的酶生产及酶催化工艺，该路线高效、低成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物化工
，具体涉及一种具有顺式环氧琥珀酸水解酶活性的编码基因，同时涉及将该基因在大肠杆菌工程菌株中进行分泌型表达，使重组菌有氧培养后的发酵液能够直接进行酶转化，催化顺式环氧琥珀酸水解为D-酒石酸。
技术介绍
D-酒石酸是L-酒石酸的同型异构体，在自然界中含量稀少，但其用途广泛，尤其在制药行业可作为手性源及拆分剂，用于D-葡萄糖-甘油-1,5-内酸胺、D-半乳糖-甘油-1,5-内酰胺、肿瘤活性天然产物以及C2位邻二胺等多种产品的合成。目前发现的可以产D-酒石酸的微生物包括恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、产碱杆菌(Alcaligenes)和博德特氏菌(Bordetella)。2000年Ikuta等分离获得一株产碱杆菌，其底物转化率可达96％以上，已应用于工业化生产，但其转化时间较长，且菌株培养过程难度大，培养成本高。随着分子克隆技术的兴起，重组的基因工程菌能大大提高目的蛋白的表达量，从而大幅度提高细胞的生物学活性。目前已经报道了产L-酒石酸的诺卡氏菌和红球菌的CESH基因序列，并将其基因工程菌应用于工业化生产，工程菌的活力是野生菌活力的20倍。另外还报道了产D-酒石酸的产碱杆菌和博德特氏菌的CESH酶基因序列，其工程菌的酵活是野生菌活力的50多倍。E.coliBL21来源于B株，为Lon蛋白水解酶、ompT外膜蛋白水解酶缺陷型，因此,表达的外源蛋白在该体系中有更高的稳定性，常用于表达外源蛋白。然而，在E.coli中表达的外源蛋白常常会发生各种问题，例如，形成不溶的包涵体等，原因大多是采用高效的pET表达载体，由于较快的蛋白质表达速率，导致没有进行正确的折叠。本专利技术针对D-酒石酸合成中存在的问题以及大肠杆菌中蛋白表达的问题，公开了一种新的环氧琥珀酸水解酶编码基因及应用与D-酒石酸高效合成的方法。
技术实现思路
本专利技术的目在于针对现有D-酒石酸合成以及大肠杆菌中蛋白表达中存在的问题，提供一种可用于D-酒石酸高效合成的新型环氧琥珀酸水解酶编码基因。为实现上述技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一种环氧琥珀酸水解酶编码基因cesH，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。优选的，在环氧琥珀酸水解酶编码基因起始密码子和第二个密码子之间插入一段信号肽，该信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，形成新的环氧琥珀酸水解酶编码基因序列。本专利技术的第二目的是提供含有上述编码基因的表达载体及基因工程菌。所述表达载体选用质粒；质粒选用PET系列表达质粒；优选含有pelB信号肽的pET-(X)b系列，其中X代表数字。选用E.coliBL21(DE3)宿主菌构建所述基因工程菌，所述的基因工程菌能够分泌型表达环氧琥珀酸水解酶，具有低包涵体生成。本专利技术的第三目的在于提供所述环氧琥珀酸水解酶在D-酒石酸合成中的应用。本专利技术的第四目的在于提供一株催化顺式环氧琥珀酸制备D-酒石酸的基因工程菌。所述基因工程菌能够分泌表达本专利技术的环氧琥珀酸水解酶，基因工程菌有氧培养后的发酵液能够直接进行酶转化，催化顺式环氧琥珀酸水解为D-酒石酸。为实现上述技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一株催化顺式环氧琥珀酸制备D-酒石酸的基因工程菌，其分类命名为大肠埃希氏菌EscherichiacoliCM-TA-122，已于2016年9月5日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为：CCTCCNO：M2016456。上述基因工程菌CM-TA-122，在发酵制备D-酒石酸中的应用在本专利技术的保护范围之内。本专利技术提供了一种基因工程菌CM-TA-122在发酵制备D-酒石酸中的具体应用方法，具体如下：其中，发酵液的培养过程如下：(S1)将重组菌按体积分数为1～2％从冻存管转接到LB培养基中，有氧培养10～12h；(S2)将S1中的培养液按体积分数为1～2％转接到种子发酵罐的LB培养基中，有氧培养至OD600在2.5～4；(S3)将S2中的培养液按体积分数为5～10％接种发酵培养基，所述发酵培养基的配方为：0.02％MgSO4·7H2O，0.1％KH2PO4，0.5％NaCl，1.0％环氧琥珀酸钠，2.0％玉米浆干粉，1.0％乳糖，有氧培养时间12～16h。步骤(S1)和(S2)中，培养温度控制在32～35℃，步骤(S3)的温度控制在25～28℃。步骤(S1)和(S2)不控制溶氧，步骤(S3)中溶解氧需控制在5～40％，且培养过程pH用氨水调节为7.0～7.5。另一方面，利用发酵液进行酶转化的过程如下：通过(S3)步骤有氧培养获得含菌发酵液，将含菌发酵液按1:10～15的体积比添加到1～1.2mol/L的环氧琥珀酸钠溶液中，控制pH在6.6～6.8，温度控制在40～45℃，转化时间控制在1～2h。pH的控制可采用环氧琥珀酸钠溶液在配置时采用pH为6.6～6.8的缓冲液，也可利用在线pH检测及反馈系统，通过自动补加NaOH或KOH控制pH在6.6～6.8。本专利技术利用挖掘的新顺式环氧琥珀酸水解酶编码基因，建立了适合工业化操作的酶生产及酶催化工艺，该路线高效、低成本。附图说明图1是重组质粒pET-20b-cesH构建过程示意图。图2是重组质粒pET-20b-cesHO构建过程示意图。图3是SDS-PAGE电泳图；其中LaneM指蛋白marker；Lane1为CM-TA-122可溶性蛋白电泳图；Lane2大肠杆菌BL21(DE3)-pET-20b-cesH可溶性蛋白电泳图。图4是顺式环氧琥珀酸钠对酶催化合成D-酒石酸效率的影响曲线图。本专利技术所述的生物材料，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)CM-TA-122，已于2016年9月5日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为：CCTCCNO：M2016456，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例1本实施例说明构建表达顺式环氧琥珀酸水解酶的表达质粒，并将其导入BL21(DE3)宿主中，构建获能重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET-20b-cesH的过程。1、构建表达顺式环氧琥珀酸水解酶的表达质粒，其过程包括：(1)人工设计并合成一段基因序列，即顺式环氧琥珀酸水解酶编码基因(SEQIDNO：1)，同时最终合成的基因在其两端带有XbaI和EcoRI酶切位点序列。(2)将质粒pET-20b及上述人工合成的基因用XbaI和EcoRI进行双酶切，并连接获得重组质粒pET-20b-cesH。酶切和连接过程参考TAKARA公司限制性内切酶和连接酶的使用说明书。重组质粒的构建过程及载体图谱如图1所示，其测序结果与设计的基因序列100％一致。2、将重组质粒pET-20b-cesH导入BL21(DE3)，获得的阳性转化子即为本专利技术的新构建菌株BL21(DE3)-pET-20b-cesH。实施例2本实施例说明构建超量表达顺式环氧琥珀酸水解酶的表达质粒，并将其导入BL21(DE3)宿主中，构建获得重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET-20b-cesHO的过程，即C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环氧琥珀酸水解酶编码基因，其特征在于，所述编码基因编码如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种环氧琥珀酸水解酶编码基因，其特征在于，所述编码基因编码如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述环氧琥珀酸水解酶编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。3.根据权利要求1所述的环氧琥珀酸水解酶编码基因，其特征在于，在环氧琥珀酸水解酶编码基因起始密码子和第二个密码子之间插入一段信号肽，该信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。4.含有权利要求1或3所述环氧琥珀酸水解酶编码基因的表达载体。5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，表达载体选用质粒；质粒选用PET...

【专利技术属性】
技术研发人员：马江锋，潘春，
申请(专利权)人：常茂生物化学工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32