本发明专利技术公开了一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其生产葡萄糖酸的应用。该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为葡萄糖酸脱氢酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌。通过将克雷伯氏肺炎杆菌中葡萄糖酸脱氢酶的编码基因进行失活来获得所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌。利用所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产葡萄糖酸，具有较高的底物转化率，较高的生产强度和较高的产物终浓度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于菌株的基因工程改造
，具体涉及改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其生产葡萄糖酸的应用。
技术介绍
葡萄糖酸是一种重要的大宗有机酸，葡萄糖酸金属盐广泛应用于保健食品领域作为补充钙、铁、锌等元素的补充剂。葡萄糖酸盐还是重要的药品，应用于多种病症治疗。葡萄糖酸及其盐具有很好的螯合作用，应用于冷却用水等的缓蚀阻垢。葡萄糖酸及其盐作为除垢剂用于钢铁和玻璃等表面清洗。葡萄糖酸及其盐应用到混凝土是一种很好的缓凝剂，增加混凝土的可塑性和强度。葡萄糖酸还是土壤中解磷微生物解磷的主要代谢产物，葡萄糖酸与土壤中的钙离子结合，而释放出磷酸根，供给植物磷源。葡萄糖酸生产多数以葡萄糖为原料通过化学或生物方法生产。化学法生产葡萄糖酸可以通过化学氧化剂，如双氧水等在贵催化剂的催化下进行氧化。葡萄糖为原料通过电化学氧化也可以生产葡萄糖酸。也有报道在超声波作用下利用碘氧化葡萄糖生产葡萄糖酸。葡萄糖酸可以通过生物法进行生产，多种微生物可以代谢葡萄糖生成葡萄糖酸，其中葡萄糖酸生产能力比较高的主要是黑曲霉(Aspergillus niger)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)和氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)等。目前在我国工业上主要是利用黑曲霉发酵葡萄糖生产葡萄糖酸。克雷伯氏肺炎杆菌是一种重要的工业微生物，可用于1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、2-酮基葡萄糖酸、乙偶姻等生产。一般生物体中细胞外的葡萄糖通过细胞膜上磷酸烯醇式丙酮酸依赖的转运系统进入胞内，同时磷酸化形成磷酸葡萄糖，在胞内代谢生产各种代谢终产物，并产生能量。克雷伯氏肺炎杆菌在好氧条件下利用葡萄糖为原料主要合成2,3-丁二醇和乙酸、琥珀酸、乳酸等有机酸。但是在酸性条件下培养，克雷伯氏肺炎杆菌可以积累高水平的2-酮基
葡萄糖酸。具体内容参见申请号为201310012784的中国专利技术专利。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提供一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其生产葡萄糖酸的应用。本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案如下：一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌，该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为位于周质空间内膜上的葡萄糖酸脱氢酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌。所述葡萄糖脱氢酶是指位于细胞周质空间的葡萄糖酸脱氢酶，催化周质空间的葡萄糖酸氧化生成2-酮基葡萄糖酸。该酶蛋白由两个亚基组成，两个亚基的编码基因相邻，其在克雷伯氏肺炎杆菌342中小亚基的基因阅读框如SEQ ID NO.1所示，Genebank编号为(gene ID 6937950)；大亚基的基因阅读框如SEQ ID NO.2所示，Genebank编号为(gene ID 6934738)。所述葡萄糖酸脱氢酶的失活通过葡萄糖酸脱氢酶大亚基基因和/或小亚基基因失活来实现。利用基因重组方法对葡萄糖酸脱氢酶基因大亚基基因和小亚基基因中的一个基因进行失活或两个基因同时进行失活，从而构建获得所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌。本专利技术还提供了所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌在生产葡萄糖酸中的应用。本专利技术还提供了所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产葡萄糖酸的方法，该方法为：将改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到以葡萄糖为碳源的培养基中，进行好氧发酵培养。优选地，所述发酵培养基的组成包括：葡萄糖5-300g/L，氮源0.5-50g/L，无机盐0-10g/L。所述氮源选自玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、豆饼粉、尿素、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐；所述无机盐选自钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。优选地，所述好氧发酵条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度25-45℃，保持发酵过程中溶解氧浓度大于饱和溶氧的1％，保持发酵过程中
发酵液的pH值在3.5-6.0之间。进一步优选地，所述好氧发酵条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度30-40℃，保持发酵过程溶解氧浓度大于饱和溶氧的20％，保持发酵过程中发酵液的pH值在4-5.5之间。优选地，所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产葡萄糖酸的方法还包括：发酵过程中待葡萄糖消耗至1-20g/L时流加高浓度葡萄糖进行补料发酵。相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术通过葡萄糖酸脱氢酶失活对克雷伯氏肺炎杆菌进行改造，改造后的克雷伯氏肺炎杆菌利用葡萄糖为碳源进行发酵培养时，葡萄糖在周质空间氧化形成葡萄糖酸以后，在发酵液中积累。本专利技术提供的方法，葡萄糖转化成葡萄糖酸的转化率高，产物终浓度高，生产强度大，可用于工业化生产。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。实施例1利用基因重组方法对克雷伯氏肺炎杆菌葡萄糖酸脱氢酶基因小亚基进行失活，来实现葡萄糖脱氢酶活性失活。本实施例中的克雷伯氏肺炎杆菌采用保藏号为CGMCC 1.6366的菌株(该菌株也称为TUAC01)，其保藏地址为：为中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏。该保藏号为CGMCC 1.6366的菌株已经在授权专利技术专利ZL201310346916.8中公开，另外在公开文献(Wei Dong,Wang Min,Shi Jiping,Hao Jian.Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology.201239:12191226)中也已经公开该菌株。该菌株是一株用于生产1,3-丙二醇，2,3-丁二醇，乙偶姻和2-酮基葡萄糖酸的菌株。该菌分离自土壤，分离过程及性状描述见(Hao Jian,等.Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1,3-propanediol under aerobic conditions.World Journal of
Microbiology Biotechnology 2008,24:1731-1740)。1)利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌葡萄糖酸脱氢酶基因序列，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。克雷伯氏肺炎杆菌342是一株用于固氮研究的克雷伯氏肺炎杆菌，其全基因组已经测序，并且提交到了genebank。根据克雷伯氏肺炎杆菌342(Genbank:NC_011283)基因组信息，设计乙偶姻脱氢酶系及调控基因PCR引物，上游引物gad-s：GGGCCAGACGCTAAGCGGTTTGAAAGCGCA(SEQ ID NO.3所示)，下游引物gad-a：AACCATTGCATTTTCATCATCTGCCTTCCT(SEQ ID NO.4所示)。通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得葡萄糖酸脱氢酶小亚基基因大亚基基因以及相邻片段，通过TA克隆方法连接到pMD-18T simple质粒(商业产品)上，得到的重组质粒命名为pMD18T-gad质粒，该重组质粒上连接的来自克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366的葡萄糖酸脱氢酶小亚基、大亚基基因及相邻片段的序本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于：所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌为位于周质空间内膜上的葡萄糖酸脱氢酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌。
【技术特征摘要】
1.一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于：所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌为位于周质空间内膜上的葡萄糖酸脱氢酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌。2.如权利要求1所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于：所述葡萄糖酸脱氢酶的失活通过葡萄糖酸脱氢酶大亚基基因和/或小亚基基因失活来实现。3.如权利要求2所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于：所述葡萄糖酸脱氢酶大亚基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述葡萄糖酸脱氢酶小亚基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.权利要求1-3任一项所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌在生产葡萄糖酸中的应用。5.权利要求1-3任一项所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产葡萄糖酸的方法，该方法为：将所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到以葡萄糖为碳源的培养基中，进行好氧发酵培养生产葡萄糖酸。6.如权利要求5所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述发酵培养基的组成包括：葡萄糖5-300g/L，氮源0.5-50g/L...
【专利技术属性】
技术研发人员：郝健，王德信，魏东，柳鹏福，史吉平，姜标，王晨红，
申请(专利权)人：中国科学院上海高等研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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