一种促进人表皮细胞生长因子在大肠杆菌高效功能性表达的方法技术

本发明专利技术公开一种促进人表皮细胞生长因子在大肠杆菌高效功能性表达的方法。该方法是通过构建表达载体pET21a‑hEGF‑Mxe‑SUMO，实现了不带任何外源氨基酸的hEGF蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效可溶表达。本发明专利技术为促进外源蛋白在大肠杆菌可溶表达提供了一种有效的思路和方法，SUMO标签融合到目的蛋白C端，能够有效地提高融合蛋白的功能性表达效率，进一步在融合蛋白中间加入可以自剪切的内含肽，在还原环境中切除融合蛋白的内含肽和SUMO蛋白，获得不带任何外源氨基酸序列且具有生物学活性的人表皮细胞生长因子。本方法为复杂的真核生物蛋白质在原核表达系统的高效生产提供了理论基础与设计新思路。

Method for promoting high-efficiency expression of human epidermal growth factor in Escherichia coli

The invention discloses a method for promoting the expression of human epidermal growth factor in Escherichia coli. This method is through the construction of expression vector pET21a hEGF Mxe SUMO, achieved without any exogenous amino acids of hEGF protein in Escherichia coli BL21 (DE3) in high soluble expression. The present invention is to promote the expression of heterologous proteins in Escherichia coli can provides an effective idea and method, SUMO tag fusion protein C to the end, can effectively improve the efficiency of functional expression of fusion protein, further peptide containing the fusion protein into the middle can shear, in a reducing environment excision of fusion protein intein and SUMO protein, human epidermal growth factor obtained without any exogenous amino acid sequence and its biological activity. This method provides a theoretical basis and new design ideas for the efficient production of complex eukaryotic proteins in prokaryotic expression system.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域的基因重组表达
，具体涉及一种促进人表皮细胞生长因子在大肠杆菌高效功能性表达的方法。
技术介绍
大肠杆菌重组蛋白表达体系因其遗传背景清晰、生长周期短、待选质粒资源大等优点已经被广泛的应用于表达外源蛋白。但大肠杆菌重组蛋白表达体系也有一定的局限性，比如：对于过短或过长的外源蛋白无法有效表达，二硫键形成能力偏低，不具备真核表达体系翻译后修饰的能力，表达的外源蛋白聚集形成包涵体(Cabrita LD.,Bottomley SP.Protein expression and refolding-A practical guide to getting the most out of inclusion bodies[J].Biotechnology Annual Review,2004,10(4):31-50)。由于包涵体不具有生物学活性或活性很低，所以需要经过变性和复性才能得到有活性的蛋白。不同外源蛋白的理化性质存在一定的差异，目前并不存在一个可以提高外源蛋白可溶表达的通用策略，虽然目前国内外有大量针对蛋白质胞外复性的研究，但是复性过程费力耗时，成功率不高，经济效益较低。因此研究外源蛋白的可溶性表达具有较高的经济效益和学术意义。hEGF不仅能刺激细胞增殖、分化和迁移，在伤口愈合、器官发生和细胞信号传导中扮演着极其重要的角色。目前，hEGF已被广泛应用于医药和化妆品领域，具有很高的经济价值。由于分子内有三个二硫键，难以通过大肠杆菌表达体系高水平生产具有生物活性的hEGF蛋白。由于SUMO蛋白具有高度疏水核心，SUMO蛋白与目的蛋白进行融合表达，为融合蛋白的折叠提供成核位点，促进目的蛋白正确折叠，可有效提高融合蛋白的可溶性表达。SUMO具有良好的热稳定性，有效地阻遏大肠杆菌内源蛋白酶水解，进一步提高融合蛋白的表达量，SUMO与hEGF融合表达可以显著促进目的蛋白的可溶性表达(Su Z.,Huang Y.,Zhou Q.,et al.High-level expression and purification of human epidermal growth factor with SUMO fusion in Escherichia coli[J].Protein Pept Lett,2006,13(8):785-92)。SUMO蛋白的去除可以依靠特异性强的SUMO蛋白酶，但是SUMO蛋白酶的添加与去除会增加工艺步骤，提高生产成本。利用内含肽在不同环境下具有形成和切除特异肽键的能力，在与目的蛋白的结合部位发生自剪切，有效地切除各种目的蛋白的融合标签(Chong S.,Mersha FB.,Comb DG.,et al.Single-column purification of free recombinant proteins using a self-cleavable affinity tag derived from a protein splicing element[J].Gene,1997,192(2):271-81)。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种促进人表皮细胞生长因子在大肠杆菌高效功能性表达的方法。该方法实现人源EGF(hEGF)蛋白在大肠杆菌的高效功能性表达，显著降低蛋白质纯化成本，同时为复杂的真核生物蛋白质在原核表达系统的高效生产提供了新的设计思路，具有一定的科研意义和社会效益。构建了在N端融合内含肽表达载体pET21a-hEGF-Mxe-SUMO，实现了不带任何外源氨基酸的hEGF蛋白在大肠杆菌工程菌高效功能性表达。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种促进人表皮细胞生长因子在大肠杆菌高效功能性表达的方法，包括如下步骤：构建表达载体pET21a-hEGF-Mxe-SUMO，实现了不带任何外源氨基酸的hEGF蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效可溶表达。所述的hEGF的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述的Mxe的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述的SUMO的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。融合蛋白依次由人表皮细胞生长因子(hEGF，核苷酸序列为SEQ ID NO：1)、内含肽(Mxe，核苷酸序列为SEQ ID NO：2)和小泛素相关修饰物蛋白(SUMO，核苷酸序列为SEQ ID NO：3)组成。所述的表达载体的构建方法，通过酶切连接方法将人表皮细胞生长因子hEGF基因克隆到pET21a载体，构建pET21a-hEGF载体，通过Restriction Site-Free(RF)克隆技术将SUMO基因融合到hEGF基因的C端，内含肽Mxe基因插入hEGF和SUMO基因中间，构建表达载体pET21a-hEGF-Mxe-SUMO。包括以下步骤：a.以人工合成的SUMO-hEGF载体为模板，扩增hEGF基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，将PCR产物与表达载体pET21a进行连接，连接产物pET21a-hEGF转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α；b.以人工合成的SUMO-hEGF载体为模板，用RFES引物扩增SUMO基因，RF克隆构建pET21a-hEGF-SUMO表达载体，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α；c.以PTWIN1载体为模板，用RFEMSH引物扩增Mxe基因，RF克隆构建pET21a-hEGF-Mxe-SUMO表达载体，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α。步骤b中所述的RFES引物的序列如下：RFES-S：5′-TGAAGTGGTGGGAACTGCGCTCGGACTCAGAAGTCAATCA-3′；RFES-A：5′-TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGACCTCCAATCTGTTCGCGGT-3′。步骤c中所述的RFEMSH引物的序列如下：RFEMSH-S：5′-CTGAAGTGGTGGGAACTGCGCTGCATCACGGGAGATGCACTA-3′；RFEMSH-A：5′-CTTGATTGACTTCTGAGTCCGAAGCGTGGCTGACGAACCCGTT-3′。所述的表达载体pET21a-hEGF-Mxe-SUMO的表达方法，包括如下步骤：a.将表达载体转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)；b.诱导工程菌表达重组融合蛋白hEGF-Mxe-SUMO将步骤a中工程菌接种于含有氨苄青霉素的LB培养基，置于37℃、220rpm培养12h；然后按1：100的比例接种于含有氨苄青霉素的TB培养基中置于37℃、220rpm培养，当OD600达到0.4～0.8时加入终浓度为0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，置于25℃、180rpm培养24h。所述的hEGF蛋白获得的步骤如下：a.纯化Binding Buffer重悬表达融合蛋白的工程菌株，高压破碎，12000rpm离心后收集上清，0.22μm滤膜过滤后进行镍柱亲和层析，收集洗脱样品透析至Binding Buffer，添加终浓度为20mM的二硫苏糖醇(DTT)，室温放置过夜；b.将上述样品透析至Binding Buffer，进行第二次镍柱亲和层析，收集穿过液样品即为hEGF蛋白。通过分子生物学技术建立一种促进h本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促进人表皮细胞生长因子在大肠杆菌高效功能性表达的方法，其特征在于包括如下步骤：构建表达载体pET21a‑hEGF‑Mxe‑SUMO，实现了不带任何外源氨基酸的hEGF蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效可溶表达。

【技术特征摘要】
1.一种促进人表皮细胞生长因子在大肠杆菌高效功能性表达的方法，其特征在于包括如下步骤：构建表达载体pET21a-hEGF-Mxe-SUMO，实现了不带任何外源氨基酸的hEGF蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效可溶表达。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的hEGF的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述的Mxe的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述的SUMO的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的表达载体的构建方法，通过酶切连接方法将人表皮细胞生长因子hEGF基因克隆到pET21a载体，构建pET21a-hEGF载体，通过Restriction Site-Free克隆技术将SUMO基因融合到hEGF基因的C端，内含肽Mxe基因插入hEGF和SUMO基因中间，构建表达载体pET21a-hEGF-Mxe-SUMO。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的表达载体的构建方法，包括以下步骤：a.以人工合成的SUMO-hEGF载体为模板，扩增hEGF基因，将PCR产物与表达载体pET21a进行连接，连接产物pET21a-hEGF转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α；b.以人工合成的SUMO-hEGF载体为模板，用RFES引物扩增SUMO基因，RF克隆构建pET21a-hEGF-SUMO表达载体，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α；c.以PTWIN1载体为模板，用RFEMSH引物扩增Mxe基因，RF克隆构建pET21a-hEGF-Mxe-SUMO表达载体，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤b中所述的RFES引物的序列如下：RFES-S：5...

【专利技术属性】
技术研发人员：王菊芳，马毅，李杉，吴少敏，余结莹，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44