蚕类蜕皮激素受体EcR/USP蛋白复合物的表达及纯化的方法技术

本发明专利技术涉及蚕类蜕皮激素受体EcR/USP蛋白复合物的表达及纯化的方法，包括以下步骤：构建USP-pET-28a(+)重组载体和EcR-pET21b-MDX12重组载体；将所述USP-pET-28a(+)重组载体和EcR-pET21b-MDX12重组载体转化表达菌，培养，诱导表达重组目的蛋白复合物；将所得的重组目的蛋白复合物经镍离子亲和层析及分子筛层析进行纯化。本发明专利技术通过构建重组表达载体EcR-pET21b-MDX12、USP-pET-28a(+)，将两个载体进行共转，诱导两种蛋白的共表达，从而得到大量的重组目的蛋白复合物，然后经镍离子亲和层析柱和分子筛分离纯化可以得到纯度较高的目的蛋白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及家蚕蜕皮激素受体(ecdysterod receptor，EcR)及超气门蛋白(ultraspiracle，USP)蛋白复合物的表达及纯化方法。
技术介绍
昆虫由幼虫发育为成虫的形态变化过程称为变态(Metamorphosis)，蚕属于完全变态的昆虫，在蚕的发育过程中，要经历卵、幼虫、蛹、成虫(蛾)四个发育阶段才能完成生命周期。在蚕的生长发育过程中，要经过多次蜕皮才能成熟。蚕的蜕皮过程包括：胚胎孵化蜕皮、幼虫各年龄期间的蜕皮以及从幼虫到蛹和蛹到成虫的蜕皮。蚕的蜕皮和变态发育主要受体内蜕皮激素的控制，20-羟基蜕皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)是由包括昆虫类和甲壳类在内的节肢动物分泌的一种甾体类蜕皮激素，在蜕皮和蜕变的发展过渡阶段以及细胞分化和生殖的过程中起着重要的调节作用。20E的作用靶标由蜕皮激素接受子(ecdysteroid receptor，EcR)和过剩气门蛋白(ultraspiracle，USP)组成，两者都是蜕皮激素受体超家族的成员，前者包括5个特征结构域，分别为A/B域(转录激活域transactivation domain)、C域(DNA结合域DNA-binding domain，DBD)、D域(铰链域hinge region)、E域(配体结合域ligand binding domain，LBD)和F域5部分组成，各部分都具有特殊的结构和功能。只有EcR和USP形成异二聚体后，蜕皮激素才能结合在EcR上形成蜕皮激素-EcR/USP三聚体，然后结合在DNA上，诱导产生蜕皮调节转录因子，由蜕皮调节转录因子再调控蜕皮级联反应的相关基因族的表达。EcR与USP的异源二聚体复合物对配体和DNA的高亲和力有着极其重要的作用，EcR的空间结构具有很强的柔韧性和适应性，USP与EcR结合后起到稳定EcR配体结合域(LBD)空间结构的作用。目前已有20余种昆虫的EcR、USP被同时或单独克隆测序，并且大多已在细菌、酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞系中实现了离体表达和提取纯化。研究表明在细菌、酵母、昆虫细胞系中表达的EcR和USP蛋白，无论其粗提液，还是纯化蛋白，均可用于活性筛选及三维结构研究。目前家蚕EcR基因(BmEcR，GeneBank登录号：692756)和USP基因(BmUSP，GeneBank登录号：U06073)已经被克隆和测序。但是，目前还没有家蚕EcR/USP蛋白复合物的表达及纯化方法。因此有必要建立一种家蚕EcR/USP蛋白复合物表达及纯化方法，从而可以利用该方
法指导进一步的活性筛选及三维结构研究。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的是提供一种家蚕蜕皮激素受体EcR/USP蛋白复合物的表达及纯化方法。为达到上述目的，本专利技术提供一种蚕类蜕皮激素受体EcR/USP蛋白复合物的表达及纯化方法，包括以下步骤：(a)构建USP-pET-28a(+)重组载体和EcR-pET21b-MDX12重组载体；(b)将所述USP-pET-28a(+)重组载体和EcR-pET21b-MDX12重组载体转化表达菌，培养，诱导表达重组目的蛋白复合物；(c)将所得的重组目的蛋白复合物经镍离子亲和层析及分子筛层析进行纯化。本专利技术通过构建重组表达载体EcR-pET21b-MDX12、USP-pET-28a(+)，将两个载体进行共转，诱导两种蛋白的共表达，从而得到大量的重组目的蛋白复合物，然后经镍离子亲和层析柱和分子筛分离纯化可以得到纯度较高的目的蛋白，为以后研究其三维功能和生物学功能奠定了及其重要的基础，本专利技术还解决了蚕蜕皮激素受体蛋白可溶性差、难纯化的问题。较佳地，步骤(a)中，构建USP-pET-28a(+)重组载体包括以下步骤：(a-1)设计上游引物F：5'CCGGAATTCATGCATCCCAGCAGCTCTGTAC 3'，其中下划线部分为限制性内切酶EcoR Ⅰ酶切位点、和下游引物R：5'GGGTTCGAAGGCCTTAAGTTACATGATGTTGG 3'，其中下划线部分为限制性内切酶Hind Ⅲ酶切位点；(a-2)以蚕类USP基因为模板，用所设计的引物F和R扩增特异性片段，胶回收产物USP基因，所述USP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(a-3)将PCR割胶回收产物和pET-28a(+)载体利用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ同时进行双酶切，将酶切产物用T4连接酶连接并转化E.col TOP10感受态细胞，挑取长势良好的单菌落培养后提取重组质粒USP-pET-28a(+)。较佳地，步骤(a)中，构建EcR-pET21b-MDX12重组载体包括以下步骤：(a-1’)设计上游引物F-1：5'GGTACCGAGAACCTGTACTTCCAATCCAAGAACATACCACCATTGTCG 3'，其中下划线部分为限制性内切酶KpnI酶切位点，斜体部分为TEV酶碱基序列、和下游引物R-1：5'CTCGAGTTATAGCACCACCGGGTTG 3'，其中下划线部分为限制性内切
酶XhoI酶切位点；(a-2’)以蚕类EcR基因为模板，所述蚕类EcR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，利用引物F-1和R-1添加5’KpnI、TEV、3’TAA和3’XhoI，构建基因KpnI-TEV-EcR-XhoI；(a-3’)设计无缝(infusion)克隆上游引物F-2：5'GTGCCAGGCGGTTCT GGTACCGAGAACCTGTACTTC 3'，其中下划线部分为与线性载体互补序列、和下游无缝克隆引物R-2：5'GTGGTGGTGGTGGTG CTCGAGTTATAGCACCACCG 3'，其中下划线部分为与线性载体互补序列；(a-4’)利用通过引物F-1、R-1进行PCR扩增的产物为模板扩增目的片段，同时用KpnI和XhoI两种酶线性化载体pET21b-MDX12，将目的DNA片段和线性化载体按摩尔比为3:1的比例进行重组反应，反应完成后将产物转化E.col TOP10感受态细胞，挑取长势良好的单菌落培养后进行菌落PCR；(a-5’)将PCR、双酶切鉴定正确且测序正确的菌落摇菌培养后提取重组质粒EcR-pET21b-MDX12。较佳地，在步骤(a-3)和/或步骤(a-5’)中，用碱裂解法提取重组质粒。较佳地，步骤(b)中，将所述USP-pET-28a(+)重组载体和EcR-pET21b-MDX12重组载体转化表达菌包括以下步骤：将构建好的且测序正确的表达载体USP-pET-28a(+)转化宿主菌，得到第一重组菌，并制备第一重组菌的感受态；用EcR-pET21b-MDX12转化第一重组菌的感受态，得到第二重组菌。较佳地，所述宿主菌为E.coli BL21(DE3)、plysS、或Rossetta(DE3)，优选为E.coli BL21(DE3)。较佳地，通过CaCl2法制备第一重组菌的感受态。较佳地，步骤(b)中，培养，诱导表达重组目的蛋白复合物包括以下步骤：在含50μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml的卡那霉素的LB培养基中37℃，180rpm振荡培养至OD600＝0.6，加入终浓度为3mM的异丙本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蚕类蜕皮激素受体EcR/USP蛋白复合物的表达及纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)构建USP‑pET‑28a(+)重组载体和EcR‑pET21b‑MDX12重组载体；(b)将所述USP‑pET‑28a(+)重组载体和EcR‑pET21b‑MDX12重组载体转化表达菌，培养，诱导表达重组目的蛋白复合物；(c)将所得的重组目的蛋白复合物经镍离子亲和层析及分子筛层析进行纯化。

【技术特征摘要】
1.一种蚕类蜕皮激素受体EcR/USP蛋白复合物的表达及纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)构建USP-pET-28a(+)重组载体和EcR-pET21b-MDX12重组载体；(b)将所述USP-pET-28a(+)重组载体和EcR-pET21b-MDX12重组载体转化表达菌，培养，诱导表达重组目的蛋白复合物；(c)将所得的重组目的蛋白复合物经镍离子亲和层析及分子筛层析进行纯化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，构建USP-pET-28a(+)重组载体包括以下步骤：(a-1)设计上游引物F：5'CCGGAATTCATGCATCCCAGCAGCTCTGTAC 3'，其中下划线部分为限制性内切酶EcoRⅠ酶切位点、和下游引物R：5'GGGTTCGAAGGCCTTAAGTTACATGATGTTGG 3'，其中下划线部分为限制性内切酶HindⅢ酶切位点；(a-2)以蚕类USP基因为模板，用所设计的引物F和R扩增特异性片段，胶回收产物USP基因，所述USP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(a-3)将PCR割胶回收产物和pET-28a(+)载体利用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ同时进行双酶切，将酶切产物用T4连接酶连接并转化E.col TOP10感受态细胞，挑取长势良好的单菌落培养后提取重组质粒USP-pET-28a(+)。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，构建EcR-pET21b-MDX12重组载体包括以下步骤：(a-1’)设计上游引物F-1：5'GGTACCGAGAACCTGTACTTCCAATCCAAGAACATACCACCATTGTCG 3'，其中下划线部分为限制性内切酶KpnI酶切位点，斜体部分为TEV酶碱基序列、和下游引物R-1：5'CTCGAGTTATAGCACCACCGGGTTG 3'，其中下划线部分为限制性内切酶XhoI酶切位点；(a-2’)以蚕类EcR基因为模板，所述蚕类EcR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，利用引物F-1、R-1添加5’KpnI、TEV、3’TAA和3’XhoI，构建基因KpnI-TEV-EcR-XhoI；(a-3’)设计无缝克隆上游引物F-2：5'GTGCCAGGCGGTTCT GGTACCGAGAACCTGTACTTC 3'，其中下划线部分为与线性载体互补序列、和下游无缝克隆引物R-2：5'GTGGTGGTGGTGGTG CTCGAGTTATAGCACCACCG 3'，其中下划线...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴桃利，王涛，汪俊，陈春麟，
申请(专利权)人：中国药科大学，上海美迪西生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32