The present invention relates to a glucose dehydrogenase and L leucine dehydrogenase in Escherichia coli alone and co expression, using the method of recombinant Escherichia coli enzyme and whole cell method and L l-phenylglycine and gluconate. The present invention is: glucose dehydrogenase gene and L gene to construct the recombinant leucine dehydrogenase alone and co expression vector and transformed into Escherichia coli gene engineering bacteria. The use of recombinant enzyme and whole cell transformation method can promote the cofactor in transformation system in circulation, only need to add a small amount of exogenous cofactor or no exogenous cofactor, the cofactor recycling system can use the substrate of benzoylformic acid and glucose and high added value of L benzene glycosides acid and glucose acid, the conversion process is simple and quick, low cost. 2 4H in 5L fermentor, L phenylglycine and gluconic acid production by this method can reach 58.8g/L and 75.6g/L respectively, provides a practical and effective strategy for industrial production.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种将葡萄糖脱氢酶与L-亮氨酸脱氢酶在大肠杆菌中单独和共表达构建成NADH辅酶循环系统，利用酶法和全细胞法高效制备L-苯甘氨酸和葡萄糖酸盐的方法。
技术介绍
苯甘氨酸及其衍生物是一种重要的医药中间体，可用于合成氨苄青霉素、头孢氨苄、头孢克罗、阿莫西林、苯咪唑青霉素等内酰胺类抗生素。邻氯苯甘氨酸则是合成抗血小板抑制剂氯批格雷的重要中间体。此外苯甘氨酸还是合成多肽类激素和多种手性农药的重要中间体，随着我国医药化工行业的飞速发展，相信对苯甘氨酸及其衍生物的需求量还将会不断增加，具有广阔的应用市场。L-苯甘氨酸主要通过化学合成法、酶拆分法及酶转化法来制备，在这三种方法之中，微生物酶转化法具有特异性较强，条件温和，对环境友好等优点。微生物酶转化法制备L-苯甘氨酸可通过利用L-亮氨酸脱氢酶对苯甲酰甲酸进行转氨还原催化作用完成，这之中需要辅因子NADH的参与，而辅因子NADH价格昂贵，显然不适用于工业生产中。通过加入另外一种酶和底物可以构建辅酶偶联再生系统，Degussa公司首次利用甲酸脱氢酶提供辅因子NADH的再生并且将其应用到L-叔亮氨酸的制备中，大大提高了产物的转化率。葡萄糖酸是化工、医药及食品等产品的重要中间体，可被用来生产葡萄糖酸的衍生物如与钠、钙、锌、亚铁等金属氧化物合成制得的葡萄糖酸盐，也可直接作为一种产品，用在乳品工业上防止乳石沉淀，用在食品配方中作为酸味剂，也用来配制家用或工厂用清洗剂(替代多磷酸盐)、织物加工和金属加工的助剂、皮革矾鞣剂、去藻剂、金属除锈剂、建筑工业上混凝土的塑化剂、生物降解的螯合剂及二次采油的...
【技术保护点】
一种通过重组大肠杆菌表达葡萄糖脱氢酶和L‑亮氨酸脱氢酶用于联产L‑苯甘氨酸和葡萄糖酸的方法，其特征包括以下内容：(1)将L‑亮氨酸脱氢酶及葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中过量表达获得重组大肠杆菌；(2)酶法转化生产L‑苯甘氨酸和葡萄糖酸：首先将L‑亮氨酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶分别在大肠杆菌中过量表达获得重组大肠杆菌，将培养好的重组大肠杆菌细胞分别在pH8.0的100mM PB缓冲液洗涤，然后将细胞分别在冰浴超声破碎，在pH6.0‑8.0的100mM PB缓冲液中，在加入GDH和LeuDH酶活分别为10U/ml和6U/ml的粗酶液，0.1mM NAD+的情况下，加入700m M苯甲酰甲酸、900mM葡萄糖及0.5M的NH4Cl，利用添加50％的氨水使转化的pH保持在8.0左右，并控制转化的温度在30℃，制备得到L‑苯甘氨酸和葡萄糖酸；(3)全细胞转化法：首先将L‑亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共同在大肠杆菌中过量表达获得重组大肠杆菌，利用pH8.0的100mM PB缓冲液洗涤细胞然后以PB缓冲液等体积悬浮，在加入5％的甘油和4％的曲拉通的情况下，投入500m M苯甲酰甲酸、750mM葡萄糖及0.5M的...
【技术特征摘要】
1.一种通过重组大肠杆菌表达葡萄糖脱氢酶和L-亮氨酸脱氢酶用于联产L-苯甘氨酸和葡萄糖酸的方法，其特征包括以下内容：(1)将L-亮氨酸脱氢酶及葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中过量表达获得重组大肠杆菌；(2)酶法转化生产L-苯甘氨酸和葡萄糖酸：首先将L-亮氨酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶分别在大肠杆菌中过量表达获得重组大肠杆菌，将培养好的重组大肠杆菌细胞分别在pH8.0的100mM PB缓冲液洗涤，然后将细胞分别在冰浴超声破碎，在pH6.0-8.0的100mM PB缓冲液中，在加入GDH和LeuDH酶活分别为10U/ml和6U/ml的粗酶液，0.1mM NAD+的情况下，加入700m M苯甲酰甲酸、900mM葡萄糖及0.5M的NH4Cl，利用添加50％的氨水使转化的pH保持在8.0左右，并控制转化的温度在30℃，制备得到L-苯甘氨酸和葡萄糖酸；(3)全细胞转化法：首先将L-亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共同在大肠杆菌中过量表达获得重组大...
【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，刘巧利，周俊平，杨套伟，张显，徐美娟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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