一种无细胞表达信号蛋白的方法及表达系统技术方案

本发明专利技术涉及一种无细胞表达信号蛋白的方法及系统，所述方法包括：将信号蛋白目标基因连接到pIX3.0载体上，获得表达质粒；采用S30缓冲液提取大肠杆菌，得到大肠杆菌抽提物，所述大肠杆菌菌种为Rosetta(DE3)；配制能量供应体系，所述能量供应体系包括丙酮酸(PEP)/丙酮酸激酶(PK)、磷酸肌酸(CP)/肌酸激酶(CK)以及葡萄糖；配制氨基酸混合物及盐溶液；采用超临界法制备卵磷脂/胆固醇脂质体；将所述表达质粒加入到包括大肠杆菌抽提物、能量供应体系、氨基酸混合物、盐溶液以及卵磷脂/胆固醇脂质体的无细胞蛋白表达系统中进行表达。本发明专利技术能解决信号蛋白表达量低的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白制备领域，具体涉及一种无细胞表达信号蛋白的方法及表达系统。
技术介绍
信号蛋白大部分是膜蛋白，如何高效表达膜蛋白一直是信号蛋白研究领域的主要瓶颈,在大多数己经测序完成的各种基因组中,膜蛋白质的数量仅占全部基因数的三分之一左右而且仅有有限的膜蛋白大约九十几个的空间结构被测定,主要的原因是膜蛋白的极高疏水性导致其在细胞体内的表达产生对宿主细胞的毒性,导致蛋白质产率低,而且膜蛋白的不溶性表达和蛋白质的错误折叠会导致生物活性的降低甚至丧失。有些膜蛋白的体内表达将会干扰细胞膜的结构完整性,从而导致细胞的死亡。膜蛋白结构组学、膜蛋白功能组学研究一般需要级别的膜蛋白。所以如何实现信号蛋白的高效表达是蛋白质组学研究的热点和难点。蛋白同样在体内很难表达,很少有文章报道关于在体内的大量表达。无细胞蛋白表达体系是一种以细胞抽提物为基础的体外合成蛋白质表达技术，具有遗传背景简单、反应操控简便、快速、方便、易于高通量等优点,正在被广泛地研究和应用，已成为研究生物反应系统的重要技术手段。近年来，无细胞蛋白表达系统在复杂蛋白、毒性蛋白和信号蛋白表达方面的优势逐渐体现，展示了其在生物制药领域的重要应用潜力。无细胞蛋白合成的详细机制可概括如下：1)目标蛋白的质粒DNA或其直接的PCR产物，在T7RNA聚合酶的作用下，在体外无细胞蛋白合成系统中首先被转录为相应的mRNA。2)在无细胞蛋白合成系统中，利用抽提物中所包含的蛋白质合成蛋白表达所必须得翻译因子和酶，例如蛋白合成的氨酰-tRNA合成酶，转肽酶以及起始因子(IF)、延长因子(EF)、释放因子(RF)等，并人工补充氨基酸、tRNA和能源物质将mRNA翻译成蛋白质。3)无细胞蛋白合成系统中翻译后释放的mRNA被再次循环使用。无细胞蛋白表达系统虽然有很多优点，但是要高效的合成蛋白质，必须保证系统中各成分在蛋白表达中都发挥作用，现有的一些无细胞蛋白表达系统仍然不能很好的表达信号蛋白，存在信号蛋白表达量低等问题。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的主要目的在于提供一种无细胞表达信号蛋白的方法及表达系统，能解决信号蛋白表达量低的问题。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种无细胞表达信号蛋白的方法，包括：将信号蛋白目标基因连接到pIX3.0载体上，获得表达质粒；采用S30缓冲液提取大肠杆菌，得到大肠杆菌抽提物，所述大肠杆菌菌种为Rosetta(DE3)；配制能量供应体系，所述能量供应体系包括丙酮酸(PEP)/丙酮酸激酶(PK)、磷酸肌酸(CP)/肌酸激酶(CK)以及葡萄糖；配制氨基酸混合物及盐溶液；采用超临界法制备卵磷脂/胆固醇脂质体；将所述表达质粒加入到包括大肠杆菌抽提物、能量供应体系、氨基酸混合物、盐溶液以及卵磷脂/胆固醇脂质体的无细胞蛋白表达系统中进行表达。作为进一步的优选，所述目标基因为GPCR(G蛋白偶联受体)的质粒DNA或其直接的PCR产物。作为进一步的优选，所述目标基因为β2肾上腺素受体的质粒DNA或其直接的PCR产物，所述目标基因序列如SEQ ID NO.1所示。作为进一步的优选，所述Rosetta(DE3)菌株的对数生长期在3-5h之间。作为进一步的优选，所述S30缓冲液包括：作为进一步的优选，所述能量供应体系包括三磷酸腺苷(ATP)、鸟苷三磷酸(GTP)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、辅酶A(CoA)、丙酮酸激酶、环磷酸腺苷(cAMP)、磷酸肌酸、肌酸激酶、丙酮酸钠以及葡萄糖。作为进一步的优选，所述氨基酸包括：丙氨酸(Alanine)、精氨酸(Arginine)、天冬酰胺(Asparagine)、天冬氨酸(Aspartic acid)、半胱氨酸(Cysteine)、谷氨基酸(Glutamic acid)、谷氨酰胺(Glutamine)、甘氨酸(Glycine)、组氨酸(Histidine)、异亮氨酸(Isoleucine)、亮氨酸(Leucine)、赖氨酸(Lysine)、蛋氨酸(Methionine)、苯基丙氨酸(Phenylalanine)、脯氨酸(Proline)、丝氨酸(Serine)、苏氨酸(Threonine)、色氨酸(Trptophan)、酪氨酸(Tyrosine)以及缬氨酸(Valine)。作为进一步的优选，所述盐溶液包括醋酸镁、谷氨酸钾和醋酸钠。作为进一步的优选，所述采用超临界法制备卵磷脂/胆固醇脂质体为：将大豆卵磷脂、胆固醇溶解于乙醇中，配得卵磷脂乙醇溶液，打开超临界二氧化碳高压釜，将卵磷脂乙醇溶液混合液加入其中，密闭高压釜，经二氧化碳高压泵打入CO2，调整适宜的温度和压力，在指定的超临界温度、压强和时间下进行孵化制备脂质体，孵化结束后泄压释放CO2，旋转蒸发除去乙醇后，得到脂质体混悬液。作为进一步的优选，所述卵磷脂/胆固醇脂质体在无细胞蛋白表达系统中的加入量为12mg/mL。作为进一步的优选，所述表达时为连续性物质交换反应，通过半透膜向无细胞蛋白表达体系的反应液中连续加入补充液，用于进行高效的物质交换，及时去掉反应液的副产物，补充无细胞反应所需的底物和能量。作为进一步的优选，所述表达反应时间可达36小时。一种无细胞表达信号蛋白的系统，包括大肠杆菌抽提物、能量供应体系、氨基酸混合物、盐溶液以及卵磷脂/胆固醇脂质体，所述大肠杆菌菌种为Rosetta(DE3)，所述能量供应体系包括丙酮酸(PEP)/丙酮酸激酶(PK)、磷酸肌酸(CP)/肌酸激酶(CK)和葡萄糖。作为进一步的优选，所述卵磷脂/胆固醇脂质体的粒径为100-200nm。所述无细胞表达信号蛋白系统应用于信号蛋白表达中。本专利技术的有益效果是：(1)、本专利技术无细胞蛋白表达系统的蛋白表达量大，大肠杆菌抽提物CECF(持续交换无细胞表达)的连续表达量可以达到5mg/mL，解决了真核细胞或信号蛋白表达量不高的问题。(2)、本专利技术无细胞蛋白表达系统表达的信号蛋白具有活性，结构正确。(3)、本专利技术大肠杆菌提取液采用能避免密码子偏好的ROSETTA(DE3)菌种来制备，采用S30缓冲液提取大肠杆菌核糖体，降低了杂蛋白含量；本专利技术以测OD的方式确定大肠杆菌表达对数期，选取Rosetta(DE3)菌株的对数生长期在3-5h之间时，此时的菌体代谢旺盛，采用此生长阶段对数期的大肠杆菌菌体制备得到抽提物的活性相对较高。(4)、本专利技术采用的能量供应体系价格低，且在表达时能持续供应无细胞反应所需的能量。(5)、本专利技术采用超临界法制备卵磷脂/胆固醇脂质体脂质体，制备的脂质体粒径小，浓度更大，粒径分布均匀，能结合更多的信号蛋白，蛋白表达量更大，活性更高。(6)、本专利技术采用连续交换操作型方式进行蛋白表达，即采取连续性物质交换反应，提高了表达量，反应时间可以长达36个小时。附图说明图1为分别采用BL21(DE3)菌株和ROSETTA(DE3)菌株制备的S30提取液进行的无细胞表达电泳对比图。图2为分别添加超声法和超临界法制备的脂质体后的无细胞表达电泳对比图。具体实施方式本申请通过提供一种无细胞表达信号蛋白的方法及表达系统，解决了信号蛋白表达量低的问题。本申请实施例无细胞表达信号蛋白的方法，包括：1、将信号蛋白目标基因连接到pIX3.0载体上，获得表达质粒；2、采用S30缓冲液提本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无细胞表达信号蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括：将信号蛋白目标基因连接到pIX3.0载体上，获得表达质粒；采用S30缓冲液提取大肠杆菌，得到大肠杆菌抽提物，所述大肠杆菌菌种为Rosetta(DE3)；配制能量供应体系，所述能量供应体系包括丙酮酸/丙酮酸激酶、磷酸肌酸/肌酸激酶以及葡萄糖；配制氨基酸混合物及盐溶液；采用超临界法制备卵磷脂/胆固醇脂质体；将所述表达质粒加入到包括大肠杆菌抽提物、能量供应体系、氨基酸混合物、盐溶液以及卵磷脂/胆固醇脂质体的无细胞蛋白表达系统中进行表达。

【技术特征摘要】
1.一种无细胞表达信号蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括：将信号蛋白目标基因连接到pIX3.0载体上，获得表达质粒；采用S30缓冲液提取大肠杆菌，得到大肠杆菌抽提物，所述大肠杆菌菌种为Rosetta(DE3)；配制能量供应体系，所述能量供应体系包括丙酮酸/丙酮酸激酶、磷酸肌酸/肌酸激酶以及葡萄糖；配制氨基酸混合物及盐溶液；采用超临界法制备卵磷脂/胆固醇脂质体；将所述表达质粒加入到包括大肠杆菌抽提物、能量供应体系、氨基酸混合物、盐溶液以及卵磷脂/胆固醇脂质体的无细胞蛋白表达系统中进行表达。2.根据权利要求1所述的无细胞表达信号蛋白的方法，其特征在于：所述目标基因为G蛋白偶联受体的质粒DNA或其直接的PCR产物。3.根据权利要求1所述的无细胞表达信号蛋白的方法，其特征在于：所述Rosetta(DE3)菌株的对数生长期在3-5h之间。4.根据权利要求1所述的无细胞表达信号蛋白的方法，其特征在于：所述S30缓冲液包括：5.根据权利要求1所述的无细胞表达信号蛋白的方法，其特征在于：所述能量供应体系包括三磷酸腺苷、鸟苷三磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、辅酶A、丙酮酸激酶、环磷酸腺苷、磷酸肌...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈鹤霄，华权高，王静，马峰，徐春雷，
申请(专利权)人：武汉华美生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42