本发明专利技术公开了一种促进目标蛋白胞外表达的方法及其应用，属于生物工程技术领域。是将Bacillus cereus磷脂酶C和目标蛋白(包括胞内定位蛋白和胞外定位蛋白)在大肠杆菌中共表达，可提高胞外定位目标蛋白生产强度，实现胞内定位目标蛋白胞外表达，提高生产效率、简化后提取工艺，具有较高的学术意义和应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于生物工程技术领 域。
技术介绍
基因工程菌表达的重组蛋白的定位方式有两种：胞内定位，在一系列伴侣蛋白的 辅助下，合成于核糖体的蛋白定位在细胞基质中；胞外定位，在核糖体中合成后，目的蛋白 在自身的功能序列和宿主菌分泌系统的作用下转运至胞外基质。这两种定位方式中，胞外 定位不仅有助于蛋白折叠，还有利于降低包涵体的形成量，同时能够避免下游纯化时的破 碎细胞等操作，简化纯化步骤、降低成本，减少杂蛋白对产品的污染。因此，胞外定位在工业 生产中较胞内定位有优势。 大肠杆菌（Escherichia coli)表达系统作为目前应用最广泛、研宄最透彻的表达 系统之一，在培养周期长短、实验操作简便度等方面具有显著优势。天然情况下，大肠杆菌 具有I-V型5种蛋白分泌途径，其中研宄应用最多的是I型和II型分泌途径，又以II型分泌 途径中SecB介导的分泌途径采用较多。通常大肠杆菌中的重组蛋白合成速率是较高的，但 是重组蛋白的分泌速率各不相同，很多不能够满足生产需要，因此强化大肠杆菌重组蛋白 的分泌效率意义十分重要。 研宄表明，Thermobifida fusca角质酶具有磷脂酶B活性，能够水解磷脂酰乙醇 胺（PE，大肠杆菌细胞膜磷脂的主要成分）。T.fusca角质酶能够通过破坏大肠杆菌细胞 膜使得细胞能够向外进行非特异性渗漏从而达到促进重组蛋白胞外表达的目的。然而， T. fusca角质酶水解磷脂分子的产物之一是溶血磷脂，它有类似表面活性剂的功能，会在发 酵过程中诱发大量的泡沫，不利于发酵调控和工业放大。 本专利技术选取两种重要的工业用酶木聚糖酶和葡萄糖异构酶作为报告蛋白。内 切-β -1，4-木聚糖酶可从木聚糖主链内部随机作用于β -1，4-糖苷键，将木聚糖分解成低 聚木糖，在食品、饲料、造纸等行业均具有广泛的应用前景。葡萄糖异构酶，又称木糖异构 酶，能将葡萄糖、木糖、核糖等醛糖催化异构为相应的酮糖，目前，其主要应用领域为将葡萄 糖转化为果糖从而制备果葡糖浆。
技术实现思路
本专利技术提供了一种促进重组蛋白胞外表达的方法，是将氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的磷脂酶C基因和目标蛋白基因（包括胞内和胞外蛋白）在宿主菌大肠杆菌中共 表达，经发酵培养后收集发酵上清液。 所述方法，在本专利技术的一种实施方式中，具体是：将磷脂酶C基因和目标蛋白基因 克隆到表达载体上，得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主菌中得到重组大肠杆菌，重 组大肠杆菌发酵培养生产目标蛋白，收集发酵上清液。 所述磷脂酶C基因，在专利技术的一种实施方式中，来自Bacillus cereus磷脂酶C基 因 （NCBI 编号：CAA45502)。 所述表达载体，在本专利技术的一种实施方式中，为pETDuet-1、pCOLADuet-Ι等双启 动子载体；pUC系列，pET系列，pT7-7, pGEX等任意一种。 所述重组质粒，在本专利技术的一种实施方式中，为pET2〇M+)-XynA或 pET24a(+)-glu〇 所述宿主菌，在本专利技术的一种实施方式中，为E. coli BL21(DE3)、E. coli W3110、 E.coli JM109、E.coli JM109(DE3)或 E.coli DH5a 等任意一种。其中优选 E.coli BL21(DE3) 〇 所述目标蛋白包括胞内定位和胞外定位蛋白。胞内定位蛋白是指在一系列伴侣蛋 白的辅助下，合成于核糖体后仍定位在细胞基质中的蛋白，例如：葡萄糖异构酶（GI，NCBI 编号：AAZ55638);胞外定位蛋白是指在细胞内合成后通过宿主菌蛋白分泌途径跨膜转运 至胞外的目标蛋白；例如：内切-β-1，4-木聚糖酶（XynA，NCBI编号：AGM16410)。 所述方法，在本专利技术的一种实施方式中，包括： (1)获取不含信号肽的磷脂酶C成熟蛋白基因，连接至pMD18_T simple vector， 获得质粒pMD18-T-plc ; (2)将pETDuet-1质粒和pMD18-T-plc进行双酶切，连接酶连接过夜后，连接产物 转化入E. coli JM109感受态细胞，得到重组质粒pETDuet-1-plc ; (3)将PETDuet-1-plc和含有目标蛋白基因的重组质粒进行双酶切，连接酶连 接过夜，连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，得到含有目标蛋白基因的重组质粒 pETDuet-1-plc ； (4)将含有目标蛋白基因的重组质粒pETDuet-1-plc导入宿主大肠杆菌； (5)发酵培养步骤（4)构建的重组大肠杆菌生产目标蛋白，收集发酵上清液。 所述发酵培养，在本专利技术的一种实施方式中，具体是：将种子以5-10%的接种量 接种，诱导前培养温度为25-37°C，诱导后培养温度25-37°C，pH6. 5-7. 5,溶氧20-30% ;当 发酵初始碳源甘油基本消耗完时，开始流加补料液，所述补料液按指数流加，比生长速率控 制在μ =0.1-0. 31Γ1;当菌体干重3-10时，加入5-158·!^甘氨酸；菌体干重15-25时，开 始诱导，诱导方法为恒速流加乳糖，乳糖加量〇. 05-0. 5g · Γ1 · 1Γ1，测定菌体干重和培养基 中酶活变化，培养基中酶活不再上升时，发酵过程结束。在此条件下进行发酵培养，都能够 显著提高目标蛋白的胞外酶活比例。 本专利技术的有益效果： (1)利用磷脂酶C中的磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C除了具有磷脂酰胆碱活性外，还 具有磷脂酰乙醇胺活性的特点，通过共表达Bacillus cereus磷脂酶C，使大肠杆菌细胞膜 透性提高，不仅提高了目标蛋白的胞外酶活比例和生产强度，而且不存在产物诱发泡沫的 问题，方便了产酶过程调控更有利于工业生产的应用。 (2)胞外定位目标蛋白生产强度显著提高，例如共表达木聚糖酶的重组菌，诱 导培养时间从48h可缩短至24h，胞外酶活也从582. 7U · ι?Γ1提高到了 893. 2U · mL Λ 胞外酶活占总酶活的比例从79 %提高到了 85 %，生产强度从11. 6U · ml/1 · IT1提高到了 26. 9U · ml/1 · 1Γ1，而且上罐实验过程中不起泡沫的现象。同时胞内定位目标蛋白的胞外分 泌量从0提高到了 83%。【具体实施方式】 发酵培养基：按 IL 计，蛋白胨 0· 9-1. lg，酵母粉 I. 9-2. lg，（ΝΗ4)2ΗΡ043· 9-4. lg， KH2P0413-14g，柠檬酸I. 5-2g，无水硫酸镁0. 6-0. 7g，甘油7. 5-8. 5g，微量元素液 9. 5-10. 5ml，ρΗ6· 8-7. 0 微量元素液：FeSO4 ·7Η209· 5-10. 5g .171，ZnSO4 ·7Η202· 0-2. 5g .171， CuSO4 · 5Η200· 9-1. Ig · Γ1，MnSO4 · 4Η200· 45-0. 55g · Γ1，Na2B4O7 · IOH2OO. 2-0. 25g · Γ1， CaCl2L 9-2. Ig · Γ1，（MM)6Mo7O240.0 9-0.1 lg · Γ1。 实施例1 :磷脂酶C在大肠杆菌Ε. coli BL21 (DE3)中的表达 pETDuet-1-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种促进目标蛋白胞外表达的方法，其特征在于，所述方法是将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的磷脂酶C基因和目标蛋白基因在大肠杆菌表达系统中共表达。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，宿玲恰，姜琪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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