本发明专利技术提供了一种源于B10BR的Nrf2过表达黑素细胞株，及其在白癜风抗氧化药物筛选中的应用。本发明专利技术黑素细胞株Nrf2-B10BR，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2012年9月25日，保藏编号：CCTCC?No:?C?2012124。本发明专利技术提供了一种新型黑素细胞Nrf2过表达细胞株Nrf2-B10BR，其起源于B10BR细胞，过表达Nrf2蛋白，这一特有的生物学特性使其可以广泛应用于研究黑素细胞抗氧化机制，筛选和评估新型抗氧化药物等，具有较高的科研和生产应用的价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种源于BlOBR的Nrf2过表达黑素细胞株，及其在白癜风抗氧化药物筛选中的应用。
技术介绍
白癜风是由于表皮黑素细胞缺失引起的色素障碍性皮肤病，其发病机制不明确，临床治愈困难。近几年人们对于黑素细胞缺失机制有了新认识内源性损伤导致了免疫应答，进而引起黑素细胞自毁，引发白癜风(J Invest Dermatol. 2005, 124(4): 798-806.)。氧化应激易引起细胞损伤，在进展期和稳定期的白癜风患者中都发现有氧化-抗氧化失衡的现象，这表明氧化应激对白癜风的发病乃至进展过程中都有重要的影响，而且这些现象的研究已直接引起临床治疗理念的革新，抗氧化治疗已成为白癜风临床治疗新策略。存在于植物、水果、蔬菜及中药中的天然的抗氧化剂不尽其数，包括多酚类化合物、黄酮类化合物、皂苷类化合物和多糖类等。绿茶提取物、槲皮素等抗氧化物能够减少过氧化氢诱导的黑素细胞死亡，具有抗氧化保护作用，临床疗效显著，可以促进白癜风患者皮损明显复色，而被普遍认为具有抗氧化作用的维生素C、叶酸、硒等对黑素细胞的抗氧化保护作用并不显著，这表明不同抗氧化剂对黑素细胞的保护作用是不同的。目前人们在白癜风研究中所用的抗氧化剂存在选择上的随机性，主要原因是目前尚无针对白癜风的高通量抗氧化药物筛选体系。药物筛选体系的建立是寻找和发现新药的重要条件之一，以往经典的抗氧化模型如过氧化氢等的检测方法比较复杂且有着明显的缺陷，因为它们不能反映化合物的抗氧化机制(如抗氧化蛋白之间的相互作用)、不能高通量和微量化检测。分子与细胞水平的筛选体系具有材料用量少，药物作用机制明确，可进行大规模筛选等特点，已成为目前药物筛选的主要方法。因此，建立白癜风抗氧化药物筛选体系是抗氧化药物筛选的重要基础，对抗氧化治疗白癜风具有重要意义。人体内具备一套完整的防止活性氧自由基损伤的抗氧化酶(如谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-PX)和过氧化氢酶(CAT)等)，维持体内自由基产生和清除的平衡，一旦平衡被破坏就会导致氧化应激。新近发现的核因子E2相关因子2 (NF-E2-related factor2, Nrf2) 是细胞调节抗氧化应激反应的重要转录因子，属于CNC (cap ‘n’collar)转录因子家族，由 bZIP、碱性区、酸性区、和cap ‘n’collar区组成，Nrf2基因位于染色体2q31，全长2884bp, 其蛋白分子量为 57 kDa (Cancer Lett. 2006，233(2) : 208-218·)。生理状态下，Nrf2 与胞质蛋白Keapl (Kelch-like ECH-associated proteinl)偶联并被锚定在胞衆,且被泛素蛋白酶体途径迅速降解。氧化应激源作用下，Nrf2从Keapl解离，然后稳定状态的Nrf2转位进入细胞核，与抗氧化反应元件(ARE)上GCTGAGTCA位点结合，启动ARE调控的II相解毒酶基因(血红素氧合酶(H0-1)和NADPH醌氧化还原酶I (NQ01))和抗氧化酶基因的表达， 提高细胞抗氧化应激能力(Free RadicBiol Med, 2004, 36(10) : 1208-1213·)。鉴于Nrf2是抗氧化反应的中枢调节者，Nrf2_ARE是调节II相解毒酶和抗氧化基因的转录激活的作用靶点，本专利技术拟通过构建包含Nrf2的真核表达载体并包裹慢病毒质粒，感染鼠永生化黑素细胞株B10BR，获得Nrf 2过表达黑素细胞株Nrf 2-B10BR，可以用于进一步构建体内外抗氧化药物筛选模型，从而深入研究黑素细胞中的抗氧化药物作用机制， 为白癜风临床治疗提供有应用价值的抗氧化药物，具有较好的临床应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株源于BlOBR的Nrf2过表达的黑素细胞株及其在白癜风抗氧化药物筛选中的应用。本专利技术采用的技术方案是一种源于BlOBR的Nrf2过表达黑素细胞株Nrf2_B10BR，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期2012年9月25日，保藏编号CCTCC No: C 2012124。该细胞株采用Nrf2编码基因(即人NFE2L2基因)过表达慢病毒感染获得。具体步骤如下1)构建人NFE2L2基因过表达慢病毒质粒；提取人黑素细胞总RNA，根据Nrf2基因序列(基因库登录号 NM006164 )设计特异性引物，NFE2L2-AgeI-F( 5，-GAGGATCCCCGGGTACCGG TCGCCACCATGATGGACTTGGAGCTGC-3’,含交换配对碱基、Age I酶切位点(下划线标记的)以及表达增强序列(双下划线记的)，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因)和 NFE2L2- Nhe I-R (5’ -TCATCCTTGTAGTCGCTAGCGTTTTTCTTAACATCTGGCTTC-3，，含交换配对碱基和Nhe I酶切位点，并含有目的基因3’端部分序列用于PCR钓取目的基因)扩增Nrf2基因1818bp。使用Age I和Nhe I双酶切消化慢病毒载体pGC-FU_EGFP_3Flag (阳性对照)， 目的基因亚克隆至慢病毒载体pGC-FU-EGFP-3Flag的Age I和Nhe I酶切位点，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，菌落PCR筛选阳性克隆并测序验证，蛋白免疫印迹检测慢病毒载体目的质粒(PGC-FU-NFE2L2 )转染293T后样品中的目的蛋白表达。2)慢病毒包装； 由上海吉凯基因化学有限公司完成，步骤如下制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，按Invitrogen 公司Lipofectamine 2000使用说明进行共转染293T细胞，转染后8 h更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中测定并标定病毒滴度。在一定滴度范围内的慢病毒颗粒可以满足大部分体内体外实验需求。3)慢病毒感染BlOBR细胞；感染前一天接种5X IO4个细胞接种于 6孔培养板中培养，每孔加2 ml培养基，病毒复感染指数为100，感染后24h观察病毒转染效率。4)检测目的蛋白；病毒感染BlOBR后获得Nrf2过表达黑素细胞株(Nrf2-B10BR)，蛋白免疫印迹观察该株细胞的目的融合蛋白Flag-Nrf2的表达，以及中药单体银杏叶提取物和抗氧化物叔丁基对苯二酚(TBHQ)作用于Nrf2-B10BR细胞后Nrf2的表达。本专利技术还涉及所述的黑素细胞株Nrf2-B10BR在白癜风抗氧化药物筛选中的应用。具体为所述黑素细胞株Nrf2-B10BR作为体外抗氧化药物筛选细胞模型用于白癜风抗氧化药物的筛选。本专利技术的有益效果主要体现在本专利技术提供了一种新型黑素细胞Nrf2过表达细胞株Nrf2-B10BR，其起源于BlOBR细胞，过表达Nrf2蛋白，这一特有的生物学特性使其可以广泛应用于研究黑素细胞抗氧化机制，筛选和评估新型抗氧化药物等，具有较高的科研和生产应用的价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。附图说明图I为倒置显微镜和荧光显微镜观察感染和未感染目的基因慢病毒质粒的BlOBR 细胞的照片；图2为蛋本文档来自技高网...
【技术保护点】
源于B10BR的Nrf2过表达黑素细胞株Nrf2？B10BR，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2012年9月25日，保藏编号：CCTCC？No:？C？2012124。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：关翠萍，许文，洪为松，
申请(专利权)人：关翠萍，许爱娥，许文，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。