人黑色素瘤抗原MAGE-A3 B细胞表位及其应用制造技术

本发明专利技术涉及人黑色素瘤抗原MAGE-A3蛋白B细胞表位重组蛋白的制备及应用。本发明专利技术公开了一种以全长的MAGE-A3蛋白为基础筛选获得的3个含B细胞表位的多肽。本发明专利技术还公开了所述B细胞表位多肽的编码氨基酸和核苷酸序列。本发明专利技术还公开了所述B细胞表位多肽在预防、治疗和诊断MAGE-A3表达阳性肿瘤中的用途。本发明专利技术所述的MAGE-A3蛋白B细胞表位重组蛋白具有很强的免疫原性和抗原性，应用前景良好。

【技术实现步骤摘要】
人黑色素瘤抗原MAGE-A3B细胞表位及其应用
本专利技术属于生物制药及诊断领域，更具体地，本专利技术涉及来自于人黑色素瘤抗原MAGE-A3蛋白上的三个B细胞表位及其编码核酸，其制备方法及其在预防、治疗和诊断MAGE-A3表达阳性肿瘤中的应用。
技术介绍
人黑色素瘤抗原(melanomaantigengenes，MAGE)基因首先在人黑色素瘤细胞系中发现，是一个大家族包括A、B、C、D、E和F六个亚家族。其中，MAGE-A3编码的肿瘤抗原是一分子量为48KDa的胞浆蛋白，由314个氨基酸残基组成。MAGE-A3基因不仅表达于以黑色素瘤为主的恶性肿瘤组织中，还以较大比例表达于多种组织类型的各种肿瘤，如肺癌、头颈部鳞状细胞癌、肝细胞癌、骨肉瘤、白血病、膀胱癌、脑瘤和卵巢肿瘤等，尤其消化道肿瘤如胃癌、食道癌、结肠直肠癌可呈高表达(参见TaharaK，MoriM，SadanagaN，SakamotoY，KitanoS，MakuuchiM.ExpressionoftheMAGEgenefamilyinhumanhepatocellularcarcinoma.Cancer，1999，85(6)：1234-1240；FischerC，GudatF，StulzP，NoppenC，SchaeferC，ZajacP，TrutmannM，KocherT，ZuberM，HarderF，HebererM，SpagnoliGC.HighexpressionofMAGE-3proteininsquamouscelllungcarcinoma.IntJCancer1997，71(6)：1119-1121；InoueH，MoriM，HondaM，LiJ，ShibutaK，MimoriK，UeoH，AkiyoshiT.Theexpressionoftumor-rejectionantigen″MAGE″genesinhumangastriccarcinoma.Gastroenterology.1995；109(5)：1522-5.)。MAGE-A3抗原在除睾丸和胎盘组织外的正常组织细胞不表达，但由于睾丸和胎盘组织的固有生理屏障可以避免由MAGE-A3被识别产生的自身免疫损伤，因此，MAGE-A3为肿瘤特异性的肿瘤共同抗原。同时也证明了其具有良好的免疫原性，因而认为MAGE-A3是肿瘤特异性免疫诊断和治疗的理想靶抗原。(参见VandenEynde，B.J.，andP.vanderBruggen.Tcelldefinedtumorantigens.Curr.Opin.Immunol.1997，9：684-693；Marturano，J.，R.Longhi，V.Russo，andM.P.Protti.EndosomalproteasesinfluencetherepertoireofMAGE-A3epitopesrecognizedinvivobyCD4Tcells.CancerRes.2008，68：1555-1562；Manici，S.，T.Sturniolo，M.A.Imro，J.Hammer，F.Sinigaglia，C.Noppen，G.Spagnoli，B.Mazzi，M.Bellone，P.Dellabona，andM.P.Protti.MelanomacellspresentaMAGE-3epitopetoCD4cytotoxicTcellsinassociationwithhistocompatibilityleukocyteantigenDR11.J.Exp.Med.1999，189：871-876.)目前，肿瘤是我国的多发病和常见病，已严重威胁人类健康，采取有效的治疗和控制措施已迫在眉睫。虽然，以手术和放疗、化疗为主的肿瘤的治疗有了长足的进步，但疗效尚不能令人满意。近年来，大量实验研究表明，基于肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)发展起来的肿瘤治疗性疫苗，能有效激活免疫系统、杀伤肿瘤细胞，因而寻求基于肿瘤抗原的有效疫苗是防治肿瘤的主要途径之一。目前，肿瘤疫苗的研究有：①肿瘤细胞疫苗：用逆转录病毒、腺病毒载体将外源基因导入肿瘤细胞内以提高肿瘤细胞的免疫原性，实验证明在体内外能诱导特异性的CTL反应。但自体肿瘤细胞疫苗易致耐受，而异体肿瘤疫苗又易被机体清除。②合成多肽疫苗：随着分子模拟技术和计算机技术对各种肿瘤抗原表位筛选的应用，越来越多肿瘤抗原Th和CTL表位的被发现、鉴定，TAA或TSA的特异性CTL表位肽，可产生特异性的抗肿瘤免疫。合成多肽疫苗已进入临床II期试验，但免疫原性弱是其一大缺点。③DNA疫苗：选用TAA或TSA基因克隆到质粒载体后作为疫苗，可在体内外有效地刺激机体产生特异性的抗肿瘤CTL免疫效应。。④肿瘤抗原负载的树突状细胞(DC)疫苗：将TAA或TSA的CTL表位多肽诱导DC作为疫苗，可诱导机体产生特异性免疫保护效应，用MAGE-3CTL多肽处理的DC，观察到7位进展期胃癌肿瘤患者中的3位发生了肿瘤消退。⑤肿瘤抗原嵌合多表位的研究：我国研究者报道，对3个前列腺肿瘤特异性抗原的多个T细胞表位进行预测、筛选、鉴定，并通过分子克隆技术构建了嵌合DNA疫苗，并将趋化因子和免疫球蛋白的Fc段基因共同克隆在真核载体上，制备了趋化肿瘤抗原基因疫苗，在小鼠体内产生了有效的抗肿瘤免疫效应。总之，以表位为基础的疫苗研究显示了其治疗和预防肿瘤的诱人前景。表位是抗原分子中可与CTL、Th和B细胞表面受体结合，并诱导特异性细胞免疫和体液免疫反应，从而产生免疫保护作用的一段氨基酸序列。表位疫苗(Epitopevaccine)是新近发展起来，具有独特设计思路，以抗原表位为基础制备的疫苗。由于表位疫苗设计的独特性，与减毒活疫苗、灭活苗及其他几种新型的疫苗相比，表位疫苗具有：①安全、无毒、稳定，可以直接刺激机体产生特异性免疫反应，其分子结构小而简单，不会引起自身免疫反应或免疫抑制；②可对抗原表位进行精确的定位，并可对T、B细胞抗原表位进行不同组合，制成针对多种病原体的疫苗。因而，通过筛选富含多个CTL、Th和B细胞优势表位的氨基酸序列为抗原，可达到既能诱导免疫应答又可减少免疫病理反应的目的；能够有效增强表位提呈的效率；同时可保持B细胞表位的天然构象等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供MAGE-A3蛋白上三种B细胞表位的重组蛋白，其编码核酸、其制备方法及其应用。在本专利技术的第一方面，提供三种分离的B细胞表位蛋白，所述蛋白的氨基酸序列分别为：(a)MAGE-A3蛋白上第5-23位氨基酸序列；和(b)MAGE-A3蛋白上第112-131位氨基酸序列；和(c)MAGE-A3蛋白上第232-246位氨基酸序列。在一个优选例中，所述的蛋白不包括全长的MAGE-A3蛋白(SEQIDNO：7)。在另一优选例中，所述的蛋白具有SEQIDNO：1、NO：2和NO：3所示的氨基酸序列。在另一优选例中，所述的蛋白的氨基酸序列分别如SEQIDNO：1NO：2和NO：3所示。在本专利技术的第二方面，提供三种分离的MAGE-A3蛋白B细胞表位的核酸，所述核酸编码所述的蛋白。在另一优选例中，所述的核酸的核苷酸序列选自：(1)SEQIDNO：4所示的核苷酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
来自人黑色素瘤抗原MAGE？A3蛋白的三个分别含多个T和B细胞表位(免疫优势表位)的氨基酸序列分别为：(a)MAGE？A3蛋白上第5？23位氨基酸序列；和(b)MAGE？A3蛋白上第112？131位氨基酸序列；和(c)MAGE？A3蛋白上第232？246位氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.来自人黑色素瘤抗原MAGE-A3蛋白的B细胞表位，其特征在于，所述表位为MAGE-A3蛋白上第5-23位氨基酸序列。2.如权利要求1所述的B细胞表位，其特征在于，所述的B细胞表位的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。3.编码如权利要求1所述的B细胞表位的核酸。4.如权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述的核酸序列如SEQIDNO：4所示。5.一种重组载体，所述载体包含权利要求3或4所述的核酸。6.一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞：(i)含有权利要求5所述的载体；或(ii)基因组中整...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱冠保，张丽芳，程骏，朱珊丽，刘纳新，薛向阳，沈贤，陈俊，
申请(专利权)人：温州医学院，
类型：发明
国别省市：